Summary

ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili<em> Clostridium difficile</em> Gerilme R20291

Published: December 10, 2016
doi:

Summary

Bu protokol klinik olarak ilgili ve genetik uysal gerginlik, R20291 kullanarak Clostridium difficile enfeksiyonu (CDI) sefoperazon fare modeli özetliyor. Klinik hastalık izleme, C. difficile bakteriyel numaralandırma, toksin sitotoksisite ve bir fare modelinde CDI genelinde histopatolojik değişikliklere vurgu protokolde ayrıntılı olarak verilmiştir.

Abstract

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Introduction

Clostridium difficile hayatı tehdit eden ishal 1 neden olan bir anaerobik, gram pozitif, spor oluşturan basildir. C. difficile enfeksiyonu (CDI) yıl 1-4 başına sağlık maliyetlerinde üzerinde 4800000000 $ artmış, insan morbidite ve mortalite ve sonuçları ile ilişkilidir. 2013 yılında, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri kamu sağlığı 1 acil tehlike teşkil ettiğini gösteren, acil antibiyotik direnç riski C. difficile kategorize. Şu anda, antibiyotik vankomisin ile tedavi ve metronidazol CDI 5 için standart bakım olarak kabul edilir. Hastaların 2,5-7% 30 – Ne yazık ki, antibiyotik başarılı tedavi sonrası CDI tekrar 20 meydana gelen, yüksek. Bu nedenle, bu enterik patojene karşı yeni terapötiklerin keşfi gereklidir. C. difficile, ac insan hastalığı yaklaşan bir hayvan modelinde karşı ilaç gruplarına değerlendirmeklinically-İlgili suşu gereklidir.

Başlangıçta, Koch Postülatları bir klindamisin ile tedavi edilen Suriye hamster modeli 8 kullanılarak 1977 yılında C. difficile için kurulmuştur. Bu model hala patogenezi 9,10 C. difficile toksin etkilerini araştırmak için bugün kullanılmaktadır. Ancak, CDI Hamster modelinde yüksek mortalite oranları ile sonuçlanır ve CDI 10,11 insanlarda görülebilir kronik sinsi hastalık belirtilerinin yaklaştığı değildir. Araştırmada sıçangil platformlar erişilebilirlik ve reaktif durumuna göre, CDI bir fare modeli uygundur.

2008 yılında, CDI sağlam bir fare modeli klindamisin 12 bir intraperitoneal enjeksiyon, ardından 3 gün bir antibiyotik içme suyu kokteyl (kanamisin, gentamisin, kolistin, metronidazol ve vankomisin) fareler muamele edilmesiyle kurulmuştur. CDI ve şiddetli kolit duyarlı Bu hale fareler. bağlıuygulanan aşı doz ing, klinik belirti ve letalitesinin bir dizi bu model kullanılarak görülebilir. Bu zamandan beri, çeşitli antibiyotik rejimleri C. difficile gastrointestinal sistem kolonize olabilir noktaya kolonizasyon direnci azalan, fare bağırsak Mikrobiyota değiştiren incelenmiştir (En ark gözden geçirdik. Ve Lawley & Young) 13,14.

Daha yakın zamanlarda, 5 ya da 10 gün boyunca içme suyu verilen geniş spektrumlu sefalosporinler, sefoperazon, tekrarlanabilir CDI 15 duyarlı fare oluşturur. Üçüncü kuşak sefalosporin verilmesinin insanlarda CDI riski ile ilişkili olduğundan, sefoperazon modelinin kullanımı daha doğru bir hastalık 16 doğal olarak meydana gelen yansıtır. Sefoperazon ile tedavi edilen C. difficile duyarlı fareler C. difficile sporlarının ve klinik olarak değişen suşları çeşitli bitkisel hücreler hem meydan edilmiştiralaka ve virülans 17. Bulaşıcı form olarak C. difficile vejetatif hücreleri kullanılarak özgün çalışmaların bazılarında rağmen, C. difficile sporlarının iletim 18 ana mod olarak kabul edilir.

Son on yılda, C. difficile R20291, bir NAP1 / BI / 027 suşu, CDI 19,20 salgınlara neden ortaya çıkmıştır. Biz sefoperazon ile tedavi edilmiş fareler klinik olarak ilgili ve genetik uysal C. difficile suşu, R20291 aşılandığında hastalığın klinik seyrini belirlemeye çalıştık. Bu protokol kilo kaybı, bakteri kolonizasyonu, toksin sitotoksisite ve C. difficile R20291 sporları ile meydan farelerin gastrointestinal sistemde histopatolojik değişiklikler de dahil olmak üzere, klinik seyir ayrıntıları. Genel olarak, bu fare modeli CDI insan hastalığı yaklaştırmak için değerli bir deney platformu olduğunu kanıtlamaktadır. Bu özelliği, fare modeli, etkilerini değerlendirmek için kullanılabilirklinik hastalığın iyileştirilmesi ve C. difficile karşı kolonizasyon direnci restorasyonu yeni tedavi yöntemleri.

Protocol

Etik Açıklama: Veteriner North Carolina State University College'da Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (NCSU) bu çalışmayı onayladı. NCSU Hayvan Bakım ve politika Kuzey Carolina Devlet 1985. Laboratuar hayvanları tesislerinin Hayvan Refahı Yasası ve Sağlık Araştırması Uzatma Yasası belirtilen standartlar ve ilkeler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için Kılavuzu'nda belirtilen kurallara uymak geçerlidir kullanın. Hayvanların sağlık duruml…

Representative Results

temsili bir çalışma sırasında, 5 haftalık C57BL / 6 ağırlık fareleri 5 gün boyunca içme su (0.5 mg / ml) içinde Cefoperazone'un ile önceden işleme tabi tutulmuş ve 2 gün düzenli içme suyu ile yıkayın izin verildi. Farelere 0. günde (Şekil 1A) oral gavaj yoluyla C. difficile R20291 10 5 sporları ile tehdit edildi. Fareler 14 gün boyunca CDI kilo kaybı ve klinik bulgular (uyuşukluk, iştahsızlık, ishal ve kambur duruş) i…

Discussion

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Trevor Lawley at the Wellcome Trust Sanger Institute for C. difficile R20291 spores and James S. Guy at the North Carolina State University College of Veterinary Medicine for Vero cells, both utilized in this manuscript. Animal histopathology was performed in the LCCC Animal Histopathology Core Facility at the University of North Carolina at Chapel Hill, with special assistance from Traci Raley and Amanda Brown. The LCCC Animal Histopathology Core is supported in part by an NCI Center Core Support Grant (2P30CA016086-40) to the UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. We would also like to thank Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie, and Cassie Schumacher for helpful discussions on the Vero cell cytotoxicity assay protocol. JAW is funded by the Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training grant T32OD011130 by NIH. CMT is funded by the career development award in metabolomics grant K01GM109236 by the NIGMS of the NIH.

Materials

#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
1ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1X PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1X Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5-8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

References

  1. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  2. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  3. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, 88-92 (2012).
  4. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  5. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile–more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  6. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  7. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  8. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
  9. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  10. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  11. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  12. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  13. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  14. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  15. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, 19-31 (2008).
  16. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  17. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  18. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  19. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  20. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  21. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , (2009).
  22. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787 (2013).
  23. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  24. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S., Dintzis, S. M. . Comparative Anatomy and Histology. , 15-40 (2012).
  25. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , (2008).
  26. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
  27. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  28. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
  29. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  30. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  31. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
  32. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).

Play Video

Cite This Article
Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

View Video