Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
La transferencia de genes y proteínas a nivel micro del organismo desempeña un papel central en la supervivencia bacteriana y evolución, así como los procesos de infección. El intercambio de ADN entre bacterias o entre una bacteria y una célula se puede lograr a través de la transformación, conjugación o transducción de vector. 1,2 La conjugación es único en comparación con la transformación y la transducción en que durante la conjugación entre las bacterias gram-negativas tales como Escherichia coli, la transferencia de DNA se produce de una manera controlada de donantes mediante el cual un sistema macromolecular compleja conecta las células donantes y receptores. La conjugación es también la manera más directa en la cual las células bacterianas interactúan con las células huésped para inyectar los genes, las proteínas o los productos químicos en los sistemas de acogida. 3 Muy a menudo, la transferencia de dichos agentes tienen efectos notables sobre el anfitrión, que van desde la patogénesis y la carcinogénesis de acoger la evolución y la adaptación. Se ha demostrado que recombinatio conjugativon aumenta la tasa de adaptación de 3 veces en las bacterias con altas tasas de mutación en condiciones de estrés ambiental. 4 Por otra parte, la conjugación es, con mucho, la ruta más común a través del cual se extienden los genes de resistencia a antibióticos en cepas bacterianas. 5,6
Los microorganismos han evolucionado los sistemas de secreción especializados para apoyar la transferencia de macromoléculas a través de las membranas celulares; en la actualidad hay 9 tipos de sistemas de secreción (DST) en bacterias gram negativas que se han descrito: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, así como la SEC (secreción) y Tat (de dos arginina translocación) vías. 7,8 Cada tipo de sistema de secreción se divide en diferentes subtipos, una necesidad debido a la diversidad de las proteínas y el carácter distintivo de vías existentes en diferentes cepas bacterianas. Por ejemplo, en el sistema de secreción de tipo IV (T4SS), los sistemas de Ti y Cag facilitar el transporte, mientras que el efector F-plásmido, R27 unand pKM101 T4SSs facilitar la transferencia de un plásmido conjugativo. 7,9,10 Una comprensión detallada de los mecanismos por los cuales los organismos ensamblan sus respectivos sistemas de secreción de proteínas de sus componentes y comparten contenido celular con un receptor o su entorno es un factor importante en el desarrollo de estrategias dirigidas a combatir los microorganismos y procesos de patógenos la infección celular.
Después de la conjugación bacteriana identificación inicial en E. coli por Lederberg y Tatum, 11 se han identificado y caracterizado un gran número de plásmidos móviles y conjugativo. 12 Tales plásmidos móviles muestran una considerable gama es de tamaño (de 1 a más de 200 kilobases (kb)), sin embargo todos los plásmidos móviles contienen una relaxasa, que reconoce el origen de transferencia (oriT) permitiendo de ese modo la transmisión del plásmido. plásmidos de conjugación más genes codifican para el montaje de un T4SS funcional, así como un tipo deIV proteína de acoplamiento. 12 Por ejemplo, el 100 kb del plásmido F de E. coli codifica todos los genes de conjugación dentro de una región de transferencia de 33,3 kB (TRA). Los 13 genes en la región tra del plásmido F codifican todas las proteínas que facilitan la formación del pilus, el apareamiento formación de la pareja (MPF), la transferencia de ADN y las funciones de exclusión durante la transferencia de plásmido conjugativo. 10,14,15 Un volumen importante de información está disponible para conjugación T4SSs, por más detallados estudios estructurales de las proteínas y complejos de conjugación sólo se están volviendo más reciente disponible. 16-28
Con el fin de montar una visión global del proceso de conjugación, se requiere un acoplamiento de los estudios estructurales detallados para mutacional análisis de proteínas de transferencia de conjugación. Esto se puede lograr a través de ensayos de apareamiento de conjugación. Para el plásmido F, cada proteína codificada dentro de la región tra juega un papel en la co mediada-Fnjugation; Por lo tanto, el knockout / deleción de un gen de transferencia va a suprimir la capacidad de conjugación de la célula (Figura 1). Mientras plásmidos móviles más pequeños son más propicias a los procedimientos de eliminación estándar, por los plásmidos conjugativos más grandes tales como F, knockouts de genes se logran más fácilmente por medio de recombinación homóloga en el que el gen diana se sustituye con uno transmitir un gen de resistencia a antibiótico distinto. En el protocolo actual, que emplean la recombinación homóloga para sustituir un gen de transferencia de interés con cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) de la 55 kb F plásmido derivado pOX38-Tc; 29,30 plásmido resultante knockout, pOX38-Tc Δgene :: Cm, facilita la resistencia a la presencia de cloranfenicol (Cm) en el medio de crecimiento. Las células donantes que albergan pOX38-Tc Δgene :: Cm no son capaces de afectar a la transferencia de ADN conjugativo / apareamiento tal como se observa a través del uso de un ensayo de apareamiento; la eficiencia de acoplamiento de una célula donante pOX38-Tc Δgene :: Cm y un recip normalesient disminuirá o, más a menudo, ser abolida. la transferencia por conjugación del plásmido pOX38-Tc Δgene :: Cm se puede restaurar a través de una pequeña recuperación plásmido que alberga el gen de transferencia concentrados. Este plásmido de recuperación puede ser uno que proporciona la expresión constitutiva, como pK184 plásmido (pK184-gen), 31 o una que proporciona expresión inducible mientras que el plásmido se dirige correctamente el gen a la ubicación correcta dentro de la célula (citoplasma o periplasma). En consecuencia, en los ensayos de apareamiento entre este nuevo donante (que alberga pOX38-Tc Δgene plásmidos :: Cm + pK184-gen) y una célula receptora, se espera que la eficiencia de acoplamiento para restaurar a cerca de la de un ensayo normal de apareamiento donante-receptor. Este sistema permite a uno para sondear la función del gen noqueado a través de la generación de una serie de construcciones de pK184-gen (deleciones o mutaciones puntuales) y prueba de la capacidad de cada constructo para restaurar la capacidad de acoplamiento de la pOX38-Tc Δgene :: Cm albergar célula donantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
proceso de conjugación bacteriana proporciona un medio por el cual las bacterias se pueden propagar genes proporciona una ventaja evolutiva para el crecimiento en entornos difíciles, tales como la propagación de los marcadores de resistencia a antibióticos. Debido a que muchos de los plásmidos de conjugación son tan grandes, 12 estudios funcionales en las proteínas implicadas en el montaje del aparato de transferencia a través de mutaciones de los genes diana en el propio plásmido conjugativo son dif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por un Descubrimiento donación del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
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