وحيدة الخلية التعبير الجيني عن طريق المتعددة RT-QPCR لتوصيف عدم التجانس من السكان اللمفاوية نادر
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم التعبير عن مجموعة كبيرة من الجينات على مستوى نسيلي. وحيدة الخلية RT-QPCR يؤدي إلى نتائج موثوق بها للغاية مع حساسية قوية لمئات العينات والجينات.
Abstract
التعبير الجيني عدم التجانس هو ميزة مثيرة للاهتمام للتحقيق في السكان اللمفاوية. التعبير الجيني في هذه الخلايا تختلف خلال تنشيط الخلايا، والإجهاد، أو التحفيز. وحيدة الخلية التعبير الجيني تعدد الإرسال يمكن تقييم في وقت واحد من عشرات الجينات 1، 2، 3. على مستوى خلية واحدة، التعبير الجيني تعدد الإرسال يحدد التجانس السكاني 4، 5. انها تسمح للتمييز من عدم التجانس السكاني عن طريق تحديد كل من مزيج محتمل من مراحل السلائف متنوعة بين خلايا ناضجة وأيضا تنوع استجابات الخلايا للمحفزات.
وقد وصفت الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) في الآونة الأخيرة كما يبلغ عدد سكانها المستجيبات الفطرية الاستجابة المناعية 6 و 7. في هذا البروتوكول، وعدم التجانس الخلية لمؤتمر العمل الدولي انهوالتحقيق في مقصورة patic خلال التوازن.
حاليا، هذه التقنية الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقييم التعبير الجيني هو RT-QPCR. هذا التعبير الجيني التدابير الطريقة فقط جين واحد في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة لا يمكن تقدير التباين في التعبير الجيني، وأن هناك حاجة إلى خلايا متعددة للاختبار واحد. وهذا يؤدي إلى قياس متوسط التعبير الجيني للسكان. عند تقييم أعداد كبيرة من الجينات، يصبح RT-QPCR وقت-، reagent-، وطريقة تستغرق العينة. وبالتالي، فإن المفاضلة تحد من عدد الجينات أو السكان الخلية التي يمكن تقييمها، مما يزيد من خطر المفقودين الصورة العالمية.
توضح هذه المخطوطة كيف حيدة الخلية متعدد RT-QPCR يمكن استخدامها للتغلب على هذه القيود. وقد استفادت هذه التقنية من على microfluidics مؤخرا التقدم التكنولوجي 1 و 2. ردود الفعل التي تحدث في متعدد رقائق RT-QPCR لا غير شاملالعيدين المستوى نانولتر. وبالتالي، التعبير الجيني وحيدة الخلية، وكذلك التعبير الجيني متعددة في وقت واحد، لا يمكن أن يؤديها في reagent-، sample-، وبطريقة فعالة من حيث التكلفة. فمن الممكن لاختبار الجينات الخلوية توقيع التجانس على مستوى نسيلي بين مجموعات فرعية خلية ضمن مجموعة من السكان في مراحل النمو المختلفة أو في ظل ظروف مختلفة 4، 5. العمل على السكان نادر مع أعداد كبيرة من الشروط على مستوى خلية واحدة لم يعد قيدا.
Introduction
على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم التحقيق على نحو متزايد الخلايا اللمفاوية الفطرية (الاستقصائية). وعلى الرغم من عدم وجود مستقبلات مستضد معين، وأنها تنتمي إلى سلالة اللمفاوية وتمثل حراس مهم لتوازن الأنسجة والالتهابات. وتنقسم الاستقصائية حاليا إلى ثلاث مجموعات على أساس التعبير عنها من مجموعات محددة عامل النسخ وعلى قدرتها على إنتاج السيتوكينات 6 و 7.
تساهم الاستقصائية إلى العديد من حالات التماثل الساكن والفيزيولوجية المرضية في أجهزة متنوعة عبر إنتاج السيتوكينات محددة 8 و 9. لتكون قادرة على فهم دور هذه الخلايا، فمن المهم تحديد مختلف المجموعات السكانية الفرعية مؤتمر العمل الدولي في الجهاز وتحديد العلاقات التنموية. وبالإضافة إلى ذلك، تم المتعلقة ظواهر اللدونة بين مجموعات فرعية مختلفة. من خلال دراسة التباينمن الخلايا الموجودة في الجهاز واحد، فمن الممكن لتحديد مراحلها من النضج وللتمييز وظائفها المحددة.
لتوضيح تقنية وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR، وقد تم اختيار الاستقصائية الكبدية، مع التركيز بشكل خاص على عدم التجانس في إطار المجموعة نفسها لجنة القانون الدولي (نوع 1 ILC) 10. أولا، من خلال استخدام التدفق الخلوي، وتميزت ثلاثة السكان لجنة القانون الدولي واضح في الكبد. تمثل مجموعة 1 مؤتمر العمل الدولي حوالي 80٪ من المستجيبات الفطرية، في حين أن اثنين من السكان الآخرين نادرة السكان لجنة القانون الدولي الكبدي (أقل من 5٪ من المستجيبات الفطرية). تم فرز هؤلاء السكان باستخدام أعرب على نطاق واسع علامات سطح الخلية من السكان لجنة القانون الدولي. ونتيجة لذلك، تم فرزها السكان لجنة القانون الدولي في الكبد تبدو واحدة مماثلة على نطاق واسع إلى آخر.
وقد ظهرت وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR باعتبارها واحدة من أفضل التقنيات لتحقيق على وجه السرعة عدم تجانس هؤلاء السكان 11 </sتصل>. يتم تحديد اثنين من الخصائص الرئيسية من خلال الاستفادة من وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR التقنية. أولا، من خلال النظر في مستوى نسيلي، فمن الممكن لاستعادة التعبير الجيني خلية محددة للمقارنة بين الخلايا التي تعرض على ما يبدو مراحل نمو مماثلة. ثم، من خلال النظر في مجموعة مختارة مسبقا من التعبير الجيني، وسوف نحدد التوقيعات وراثية جديدة استنادا إلى أنماط التعبير الجيني في وقت واحد في نقطة مرة واحدة. هذه الجوانب تسمح جمع مجموعة متنوعة واسعة من البيانات التعبير لعدد كبير من الخلايا، حتى على السكان نادر الحدوث حيث يتم تنفيذ هذه التقنية على مستوى نسيلي. وبالتالي، عدم التجانس لجنة القانون الدولي في الكبد ويمكن تقييم كاف.
بعد ذلك، عن طريق فرز جميع الخلايا مع النمط الظاهري لجنة القانون الدولي العالمي، ويتم الحصول على نظرة واسعة للتعبير متعددة الجينات الكبد السكان لجنة القانون الدولي، على الرغم من أنها تمثل السكان نادرة للغاية. رقاقة القائم على ميكروفلويديك يسمح التجريب مع حتىكمية صغيرة من مادة الخلية. ونتيجة لذلك، فإن ملامح التعبير الجيني للسكان الخلية نادرة يمكن الحصول. استخدام الانترنت التوقيع الجيني برامج التحليل، مجموعات السكان الخلية والعلاقات المحتملة للخلايا يمكن التحقيق فيها. ونتيجة لذلك، الاختبارات الوظيفية لا يمكن أن يؤديها للتحقق من صحة البيانات التجميع على مستوى في الجسم الحي.
يمكن تقييم عشرات من تعبيرات الجين الوقت نفسه على مئات أو أكثر من الخلايا واحدة على الشريحة نفسها 3 و 11 و 12. تصميم الاختبار هو أطول وأهم جزء من التجربة. تحديد الجينات ذات الصلة لفرضية لفحصها هو الهدف الأسمى للحصول على نتائج ذات الصلة. ثانيا، هناك حاجة إلى الرقابة الداخلية (مثل علامات سطح معروفة تستخدم لفرز) وضوابط محددة. هذا أمر بالغ الأهمية لاختبار خصوصية التمهيدي التضخيم، وكفاءة التضخيم، وركان غياب المنافسة التمهيدي. لذلك، والعمل مع وحيد الخلية متعدد RT-QPCR هو أسلوب للوقت، كما يتم تقييم التعبير متعددة الجينات في خلية في نفس الوقت.
باستخدام نفس رقاقة ومزيج من المواد الكيميائية لجميع خلايا يحد من الأخطاء المحتملة من التلاعب ويسمح لاستنساخ بين العينات. وإجمالا، فإن جوانب مختلفة من وحيد الخلية متعدد RT-QPCR تسمح لإنتاج نتائج موثوق بها للغاية على مستوى نسيلي، مع مستوى كبير من الحساسية لمجموعة واسعة من العينات والجينات. النتائج التي تم الحصول عليها توفر بيانات قوية ومتينة للاختبارات الإحصاء الحيوية.
ويمكن تحقيق ذلك بسبب الجانب ميكروفلويديك من طريقة، والذي يسمح للعمل على كميات صغيرة جدا من المواد ويؤدي إلى نتائج شاملة. وأخيرا، وذلك باستخدام البرمجيات عبر الإنترنت، فمن الممكن المقارنة بين السكان المطلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على معلومات شاملة التعبير الجيني على مستوى نسيلي. هنا، ونحن التحقيق الكبد لجنة القانون الدولي عدم التجانس المقصورة. بعد الفرز وحيدة الخلية من السكان لجنة القانون الدولي مختلف (على أساس علامات سطح مؤتمر العمل الدولي أعرب على نطاق واسع)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue – inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells – a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a., Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
