Encellede Gene Expression Bruke Multiplex RT-qPCR å karakter heterogenitet av sjeldne lymfoide populasjoner
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du vurdere uttrykk for et stort utvalg av gener ved klonal nivå. Encellede RT-qPCR produserer meget pålitelige resultater med en sterk følsomhet for hundrevis av prøver og gener.
Abstract
Genuttrykk heterogenitet er en interessant funksjon for å undersøke i lymfoide populasjoner. Genekspresjon i disse cellene varierer i løpet av celleaktivering, stress, eller stimulering. Enkeltcelle multipleks genekspresjon muliggjør samtidig vurdering av flere titalls gener 1, 2, 3. Ved enkelt-celle-nivå, bestemmer multipleks genekspresjon befolkning heterogenitet 4, 5. Det gir mulighet for æren av befolkningen heterogenitet ved å bestemme både sannsynlig blanding av ulike forløper etapper blant modne celler og også mangfoldet av celle responser på stimuli.
Medfødte lymfoide celler (ILC) har nylig blitt beskrevet som en befolkning på medfødte effektorer i immunresponsen 6, 7. I denne protokollen, celle heterogenitet av ILC hanpatic Rommet er undersøkt i løpet av homeostase.
Foreløpig er den mest brukte teknikken til å vurdere genekspresjon er RT-qPCR. Denne metoden måler genekspresjon bare ett gen om gangen. I tillegg kan denne fremgangsmåte ikke anslå heterogenitet av genekspresjon, ettersom multiple celler er nødvendig for en test. Dette fører til måling av den gjennomsnittlige genekspresjon av befolkningen. Ved vurdering av et stort antall gener, blir RT-qPCR en tids, reagens og prøve krevende metode. Derfor avveiningene begrense antallet gener eller cellepopulasjoner som kan evalueres, øker risikoen for mangler det globale bildet.
Dette manuskriptet beskriver hvordan enkeltcelle multipleks RT-qPCR kan anvendes for å overvinne disse begrensningene. Denne teknikken har dratt nytte av senere MicroFluidics teknologiske fremskritt 1, 2. Reaksjoner som opptrer hos multipleks RT-qPCR chips ikke exceed den nanoliter-nivå. Derfor, encellede genekspresjon, så vel som samtidig multippel genekspresjon, kan utføres i et reagens, prøve-, og kostnadseffektiv måte. Det er mulig å teste celle-genet signatur heterogenitet på den klonale nivå mellom celleundergrupper innenfor en befolkning på forskjellige utviklingsstadier eller under forskjellige forhold 4, 5. Arbeider på sjeldne populasjoner med et stort antall forhold på enkeltcellenivå er ikke lenger en begrensning.
Introduction
I løpet av de siste årene, har medfødte lymfoide celler (ILCs) blitt stadig mer etterforsket. Til tross for sin mangel på antigen-spesifikke reseptorer, de tilhører lymfoidlinjen og representerer viktige voktere for vev homeostase og betennelse. ILCs er i dag delt inn i tre grupper basert på deres uttrykk av spesifikke transkripsjonsfaktorkombinasjoner og på deres evne til å produsere cytokiner 6, 7.
ILCs bidra til en rekke homeostatiske og patofysiologiske situasjoner i ulike organer via spesifikk cytokinproduksjon 8, 9. For å være i stand til å forstå rollen til disse celler, er det viktig å bestemme de forskjellige ILC subpopulasjoner pr organ og for å identifisere deres utviklingsmessige relasjoner. I tillegg har fenomener av plastisitet mellom de forskjellige delsettene er relatert. Ved å studere den heterogenitetenav cellene som er tilstede i ett organ, er det mulig å avgrense deres stadium av modning og for å skille sine spesifikke funksjoner.
For å illustrere teknikken av encellede multipleks RT-qPCR ble lever ILCs valgt, med særlig vekt på deres heterogenitet innenfor samme ILC gruppe (type 1 ILC) 10. Først, ved bruk av flowcytometri, ble tre distinkte populasjoner ILC karakterisert ved leveren. Gruppe 1 ILC representerer rundt 80% av de medfødte effektorer, mens de to andre bestander er sjeldne lever ILC populasjoner (mindre enn 5% av de medfødte effektorer). Disse bestandene ble sortert ved hjelp av allment uttrykt celleoverflatemarkører ILC populasjoner. Som et resultat, sortert ILC populasjoner i leveren ser stort sett lik en til en annen.
Encellede multipleks RT-qPCR har dukket opp som en av de beste teknikker for å komme til bunns i den heterogeniteten av disse populasjonene 11 </sopp>. To viktigste egenskapene bestemmes ved å dra nytte av den encellede multipleks RT-qPCR teknikk. Først ved å se på klonalt nivå, er det mulig å gjenvinne celle-spesifikk genekspresjon for sammenligning mellom celler som tilsynelatende viser tilsvarende utviklingsstadier. Deretter, ved å se på en forhåndsvalgt kombinasjon av genuttrykk, vil vi bestemme nye gen signaturer basert på samtidige genuttrykksmønster på ett tidspunkt. Disse trekkene tillater oppsamling av en rekke ekspresjonssystemer data for et stort antall celler, selv på sjeldne populasjoner, ettersom teknikken utføres ved klonal nivå. Derved kan ILC heterogenitet i leveren være tilstrekkelig vurdert.
Deretter ved å sortere alle cellene med en global ILC fenotype, er en bred oversikt over flere genekspresjon av leveren ILC populasjoner innhentet, selv om de representerer svært sjeldne populasjoner. En microfluidic-basert chip tillater eksperimentering med endaen liten mengde av cellemateriale. Som en konsekvens, kan genekspresjonsprofiler av sjeldne cellepopulasjoner oppnås. Ved hjelp av online-genet signaturanalyse programvare, cellebefolkningsgrupper og potensielle celle relasjoner kan bli undersøkt. Følgelig kan funksjonstester utføres for å validere clustering data på in vivo nivå.
Titalls genekspresjon kan bli vurdert samtidig på flere hundre eller flere enkeltceller på samme brikke 3, 11, 12. Utforming av analysen er den lengste og mest viktig del av forsøket. Bestemmelsen av de gener som er relevante for den hypotese som skal testes er av vesentlig betydning for å oppnå relevante resultater. Dernest er intern kontroll (for eksempel kjente overflatemarkører som brukes til sortering) og spesifikke kontroller nødvendig. Dette er avgjørende for å teste primer amplifikasjon spesifisitet, effektiviteten av forsterkningen, og than fravær av primer konkurranse. Derfor arbeider med enkelt-celle multipleks RT-qPCR er en tidsbesparende teknikk, som multippel-genekspresjon av en celle vurderes samtidig.
Ved å bruke den samme brikke og blanding av reagenser for alle celler som begrenser de mulige feil ved manipulering og muliggjør reproduserbarhet mellom prøver. Alt i alt har de forskjellige aspektene av enkelt-celle multipleks RT-qPCR muliggjør fremstilling av høyt pålitelige resultater på klonalt nivå, med en stor grad av følsomhet for et bredt spekter av prøver og gener. Resultatene gir kraftige og robuste data for biostatistiske tester.
Dette kan oppnås på grunn av den mikrofluid aspekt av fremgangsmåten, som gjør det mulig å arbeide med meget små mengder av materiale og fører til uttømmende resultater. Til slutt, ved hjelp av online programvare, er det mulig å sammenligne de ønskede populasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan du skaffer uttømmende genekspresjon informasjon på klonale nivå. Her undersøkte vi lever ILC rommet heterogenitet. Etter én enkelt celle sortering av ulike ILC populasjoner (basert på aner uttrykt ILC overflatemarkører), prøvene ble pre-amplifisert for spesifikke forhåndsvalgte gener. Deretter ble det oppnådde cDNA og primere applisert på en multipleks RT-qPCR mikrofluid chip. Til slutt, erholdt vi ekspresjon av 48 forskjellige gener fra 48 enkle celler. Genuttrykk resultat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue – inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells – a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a., Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
