이 프로토콜은 서브 유닛의 동시 발현 재조합 프로 테아 좀 어셈블리의보다 철저한 검사를 위해 혼합 postlysis 서브 유닛을 모두 사용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
프로 테아 좀은 삶의 모든 영역에서 발견된다. 자신의 어셈블리를 완전히 이해되지 않지만 그들은, 진핵 생물의 세포 내 단백질 분해의 주요 경로를 제공합니다. 모든 프로 테아 두 heptameric α 서브 유닛 반지 사이에 끼워 두 heptameric β 서브 유닛 반지를 포함, 구조적으로 보존 된 코어 입자 (CP), 또는 20S 프로 테아 좀 (proteasome)를 포함한다. 고세균 20S 프로 테아 좀은 진핵 생물의 대응에 비해 구조적으로 간단, 아직 그들은 모두 공통의 조립 메커니즘을 공유 할 수 있습니다. 따라서, 고세균 20S 프로 테아 좀은 진핵 세포 프로 테아 조립을위한 중요한 모델이 될 것을 계속한다. 특히, 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)와 결합 고세균 (20S)의 프로 테아 좀의 재조합 발현는 프로 테아 좀의 생합성에 많은 중요한 통찰력을 산출했다. 여기, 우리는 고세균 프로 테아 α의 동시 발현의 일반적인 전략을 개선하는 방법을 논의하고 β 서브 유닛 전에 nondenaturi하기NG PAGE. 우리는 신속하고 효율적인 있지만, 혼자 동시 발현 방식이 키 어셈블리 중간체를 놓칠 수 있다는 것을 보여줍니다. 프로 테아 좀의 경우, 동시 발현은 반 프로 테아 좀의 감지, 중간 포함하는 하나의 완전한 α-링과 하나의 완전한 β-링을 허용하지 않을 수 있습니다. 그러나,이 중간 용이 해물 혼합을 통해 검출된다. 우리는 해물 혼합과 동시 발현을 결합하는 어셈블리를 분석에 더 철저 접근을 산출, 아직 노동 nonintensive 유지하는 것이 좋습니다. 이 접근은 다른 재조합 multiprotein 복합체의 연구에 유용 할 수있다.
서론
Multiprotein 단지는 수많은 중요한 세포 활동 1을 수행한다. 이 단지의 많은, 더 많은 그들의 조립 2,3에 대한보다 자신의 구조와 기능에 대한 알려져있다. 프로 테아는 하나의 복잡하고 삶의 모든 영역에서 발견된다. 진핵 생물에서이 분자 기계는 유비퀴틴 / 프로 테아 좀 시스템 (UPS)의 핵심이며, 세포 내 단백질 분해 (4)의 주요 경로를 제공합니다. 20S 프로 테아 솜을, 또는 코어 입자 (CP) (5), 즉, 19S 규제 입자 (RP) (6)에 의해 하나 또는 양 말단에서 캡핑 될 수합니다 (26S 프로 테아라고 함) 진핵 테아는 두 개의 주요 서브 어셈블리로 이루어진다.
20 대 프로 테아 큰 구획 단백질 분해 효소이다. 그 급 구조가 절대적으로 삶의 모든 영역에 걸쳐 보존과 구조적으로 관련 서브 유닛의 두 가지 유형을 포함하는 4 ~ 7 원환의 스택으로 구성되며, α; 그리고 5,7,8을 β. 진핵 생물에있어서, 2 개의 외부 링은 각각 일곱 별개의 α 서브 유닛으로 구성되며, 두 개의 내부 링은 각각 일곱 별개 β 소단위로 구성된다; 단백질 분해 활성은 β 서브 유닛의 세 내에 존재한다. 대조적으로....
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프로토콜
1. 세균성 식입니다.
참고 : 본 연구에 사용 된 발현 플라스미드는하기 표 1에 기재되어있다. 본 연구에서 사용 된 용액, 미디어, 버퍼는 표 2에 기재되어있다. 고세균 테아 소단위 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드의 발생이 다른 18,20 설명한다. 요컨대, 서브 유닛의 재조합 동시 발현을위한 플라스미드는 각각의 서브 유닛 (18, 20)의 비교 발현 수준을 획득하는 데 도움이 bicistronic 오페론 전략을 사용한다. 아래에 나열된 식 매개 변수는이 연구에서 프로 테아 서브 유닛에 대한 최적의 것으로 경험적으로 결정했다. 다른 고세균 종에서, 또는 다른 재조합 단백질 복합체 (토론 참조) 프로 테아를 들어, 다른 프로 테아 돌연변이에 대한 표현을 최적화 할 필요가있다.
- (화학적으로 유능한 대장균 BL21에 관심의 발현 플라스미드를 변환DE3) 세포.
- 갓 얼음에 해동 된 DE3 세포의 나누어지는로 - (100 NG 일반적으로 50), 20 분 동안 얼음에 품어 계속 플라스미드의 2 μL - 1을 추가합니다.
- 열 충격 45 초 동안 ....
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결과
α 서브 유닛이 형태 링 (9)에 결합하면 프로 테아 좀 어셈블리 (그림 1) 시작합니다. C는 말단 헥사 히스티딘은 (그의 태깅) 유도체 (표 1) 태그로서 호열 Methanococcus maripaludis S2에서 α 서브 유닛을 대장균에서 발현되는 경우가 설명 될 수있다. 재조합-α 단백질 자신의 페이지를 비 변성하여 ICAR 그래피 분석 한 결과, 두 개의 밴드 (도 2A, 레인 1)을 관찰 하였다. 우리는 이전에이 싱글 α 링 (SR) 및 더블 α-링 (DR) (18)에 대응 증명하고있다. 재해 복구 이후 조립 9,18에 대한 생산되지 않는 막 다른 종입니다.
α-그의 경우 서브 유닛은 재조합 고세균 프로 테아 좀의 어셈블리가 670 kDa의 크기 스탠드 근처에 이주, 새로운 종을 관찰.......
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토론
우리는 재조합 고세균 프로 테아 좀을 이용하여 비 변성 PAGE를 테아 조립체 분석에 결합 방법의 이점을 보여준다. 프로 테아 서브 유닛의 박테리아 동시 발현의 일반적인 방법 9,11 신속한 분석이 가능하지만 키 어셈블리 중간체를 공개하지 않을 수 있습니다. 우리 조립체 이벤트의 더 넓은 영상을 개발하는 혼합 용 해물과 동시 발현을 조합 한 제안.
이러한 결합 접근법의 장점은 별도의 α 발현을 요구하고 해물 믹싱 β 서브 유닛에도 불구하고, 여전히 비교적 노동 친화적이라는 것이다. 하나가 각각의 단백질의 대등 일관된 발현 수준을 보장하는 경우는 반 정량적 결과 일 수있다. 이를 위해 파쇄 혼합 전에 발현 된 단백질의 대등 한 수준의 허용 조건을 결정하기 위해, 재조합 단백질 발현의 일반적인 최적화를 수행 바랍니다. 최적화 유도 팀을 변경 포함 할 수 있습니다즉, 온도 감응 유도 박테리아 발현 균주에서 광학 밀도 등, 가용성 단백질의 목적하는 수준까지 달성된.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 ARK로, 미국 심장 협회 14GRNT20390154에서 수상에 의해 부분적으로 인디애나 대학교 - 퍼듀 대학교 인디애나 폴리스에서 연구 지원 기금 그랜트 (RSFG)에 의해 부분적으로 지원
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참고문헌
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson,....
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재인쇄 및 허가
