פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו
Summary
אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.
Abstract
מבחני Electrophoretic Shift ניידות (Emsa) הם כלי אינסטרומנטלי לאפיין אינטראקציות בין חלבונים ורצפי DNA היעד שלהם. רדיואקטיביות כבר השיטה השלטת של תיוג DNA ב EMSAs. עם זאת, התקדמות צבעי ניאון שיטות סריקה יש הנחיות שימוש תיוג פלורסנט של DNA כחלופת רדיואקטיביות עבור היתרונות של טיפול קל, תוך חיסכון בזמן, הפחתת עלויות, ושיפור בטיחות. השתמשנו Emsa פלורסנט לאחרונה (fEMSA) כדי לטפל שאלה ביולוגית חשובה בהצלחה. ניתוח fEMSA שלנו מספק תובנה מכניסטית לתוך השפעת מוטציה missense, G73E, ב SOX-2 גורם שעתוק HMG שמור ביותר על פיזור סוג נוירון חוש הריח. מצאנו כי מוטצית SOX-2 חלבון G73E משנת פעילות מחייב DNA הספציפי, ובכך לגרום שינוי זהות נוירון חוש ריח. כאן, אנו מציגים אופטימיזציה וחסכוניים צעד-אחר-צעד פרוטוקולעבור fEMSA באמצעות oligonucleotides צבען שכותרתו ניאון אדום המכיל את LIM-4 / SOX-2 אתרי היעד סמוכים מטוהרים SOX-2 חלבונים (WT ו מוטנטים SOX-2 חלבוני G73E) כדוגמא ביולוגית.
Introduction
EMSAs משמש לנתח אינטראקציות בין דנ"א וחלבונים באמצעות אלקטרופורזה polyacrylamide ג'ל ילידים (עמוד) כדי לפתור תערובת של חלבון של עניין בדיקת DNA שכותרתו המכיל אתרי יעד פוטנציאליים של החלבון 1. בדיקת DNA קשרה עם חלבון יהגר לעומת איטית עם בדיקת DNA חופשית, ולכן הוא מפגר הגירה שלה באמצעות מטריצת polyacrylamide. Radiolabeling של DNA ב -32 P כבר השיטה השלטת לגילוי ב EMSAs. על אף שהבקשה של radiolabeling במחקר ביוכימי הועילה, שיטות תיוג DNA אלטרנטיבה ברגישות דומה שמתבצעות מועסקים בשל סיכוני בריאות ובטיחות הקשורים בטיפול רדיואקטיביות. שיטות חלופיות אלה כוללים נטיה של DNA עם ביוטין 2 או digoxigenin (DIG) 3 (אשר שניהם נלכד על ידי מערכות chemiluminescent), מכתים ירוק SYBR של הג'לים עמוד 4,או זיהוי ישיר של conjugates צבען פלורסנט DNA על ידי סריקת 5,6 ג'ל.
הג'לים נפתרו של EMSAs באמצעות בדיקות DNA שכותרתו רדיואקטיבית דורשים עיבוד postrun באמצעות סרטי autoradiography או מערכת phosphorimager לזהות אותות רדיואקטיבי 1,7. ג'לים של EMSAs באמצעות biotin- 2 או DIG-מצומדות 3 בדיקות DNA חייב גם להיות מעובד ומועבר על קרום מתאים ולאחר מכן זוהה על ידי chemiluminescence 6. SYBR מכתים ירוק של הג'ל דורש מכתים ג'ל postrun וסורק פלורסנט 4. מאז צעדים ג'ל עיבוד postrun נדרשים עבור EMSAs שימוש בטכניקות תיוג DNA אלה, הג'ל נפתרה ניתן assayed רק פעם אחת. לעומת זאת, בדיקות DNA שכותרתו עם fluorophores ניתן לאתר ישירות בתוך הג'ל בתוך לוחות זכוכית על ידי סורק. לכן, אינטראקציות חלבון ה- DNA ניתן לנטר assayed מספר פעמים בנקודות זמן שונות במהלך הריצה, אשרמקטין את זמן ועלות משמעותית. Conjugates צבע פלואורסצנטי-דנ"א שימשו במשך EMSAs כוללים Cy3 6,8, Cy5 6,8, והעמסת 9, ו צבעי ניאון אדום 4-6.
תקנת תעתיק דורשת אינטראקציות חלבון-דנ"א של גורמי שעתוק גני היעד שלהם. תיאום של אינטראקציות אלה מייצר סוגי תאים מגוונים מתוך אב משותף במהלך ההתפתחות של בעלי חיים. מסך גנטי קדימה משוחד זיהה מוטצית missense, G73E, ב HMG השמור ביותר DNA מחייבת המושלם של SOX-2 גורם שעתוק elegans Caenorhabditis. תוצאות מוטצית שינוי זהות תא של הנוירונים הרחת AWB לתוך הנוירונים הרחת AWC ברמות מולקולריות, מורפולוגיים, ופונקציונליות 5,10. SOX-2 מסדיר את בידול המסוף דיפרנציאלי של נוירונים AWB ו AWC על ידי אינטראקציה עם גורמי שעתוק השותף בהקשר תלוי בהתאמהאתרי יעד DNA 5,10. SOX-2 שותפים עם LIM-4 (LHX) ב בידול עצבי מסוף AWB, בעוד SOX-2 שותפים עם 36 CEH (OTX / OTD) ב בידול עצבי מסוף AWC. מבחני כתב בלוציפראז מראים כי SOX-2 ו מוטצית SOX-2 חלבונים G73E יש אינטראקציות שיתוף פעולה עם קו-פקטורים תעתיק LIM-4 ו CEH-36 כדי להפעיל האמרגן הביע בנוירונים AWB ו AWC. עם זאת, SOX-2 ו G73E SOX-2 מוטציה מוצגת מאפייני הפעלת הפרש של האמרגן. כדי לחקור את הבסיס המולקולרי של פעילויות מחייב DNA הפרש של SOX-2 ו- SOX-2 G73E, fEMSAs בוצע עם חלבונים אלה ואתרי היעד הפוטנציאליים שלהם.
ראשית, גישה ביואינפורמטיקה נלקחה לזהות את ה- DNA הרלוונטי הביולוגי מחייב רצפים בתוך אזור אמרגן 1 kb בשימוש assay בלוציפראז. מאז SOX-2 אתרי קישור פוטנציאל מרובים נכחו לאורך האמרגן, התמקדנועל חזה SOX-2 אתרי קישור סמוכים המשוער CEH-36 או LIM-4 אתרי מחייב שמורים באבולוציה בין מיני נמטודות שונים. רצפים אלה נמחקו או מוטציה, ולאחר מכן נבדק in vivo לפעילותם להביע transgenes הכתב GFP בנוירונים AWB או AWC. באמצעות גישה זו, זיהינו אתרי יעד סמוכים פוטנציאל LIM-4 / SOX-2 ו CEH-36 / SOX-2 כי נדרשים במיוחד עבור הביטוי של GFP בנוירונים AWB ו AWC, בהתאמה 5. חקרנו את הפרשים פוטנציאליים ב- DNA המחייב של SOX-2 ו- SOX-2 G73E באמצעות fEMSA עם LIM-4 / SOX-2 זיהו CEH-36 / SOX-2 אתרי מטרה סמוכים. ניתוח Emsa שלנו הראו כי G73E SOX-2 לא להיקשר החללית DNA המכיל את LIM-4 / SOX-2 אתרי היעד הסמוך (חובה עבור ביטוי גנים AWB) בצורה יעילה ככל WT SOX-2 עשה. עם זאת, SOX-2 ו- SOX-2 G73E לא היה הבדל מחייב בדיקת DNA המכילה את CEH-36 / SOX-2אתר היעד djacent (חובה עבור ביטוי גנים AWC) 5,10. FEMSA שלנו מנתחת לספק תובנה מכניסטית לתוך הטבע של המוטציה G73E SOX-2 לפגוע בפעילות מחייב DNA ספציפיים עבור טרנספורמציה תא זהות פנוטיפ AWB ל-AWC. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה של fEMSA באמצעות 6xHis-סוקס 2 מטוהרים או 6xHis-סוקס 2 G73E יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדום המכיל באתרי היעד LIM-4 / SOX-2 הסמוך כמקרה מבחן כדי להתמודד שאלה ביולוגית חשובה.
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs מהווים כלי יעיל לחקור אינטראקציות חלבון-דנ"א, והם אלטרנטיבה הסימון הרדיואקטיבי של DNA. צבעי ניאון כגון צבעי אינפרא אדומים זמינים מסחרי, ולספק שיטה בטוחה יותר ויותר ידידותית לסביבה לעומת תיוג DNA רדיואקטיבי. EMSAs באמצעות oligonucleotides אינפרא אדום הניאון שכותרתו לצבוע א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
