Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

Summary

Descrevemos aqui um protocolo otimizado de ensaios fluorescentes eletroforética de desvio de mobilidade (Femsa) usando SOX-2 proteínas purificadas em conjunto com sondas de DNA infravermelhos fluorescentes marcadas com corante como um estudo de caso para resolver uma questão biológica importante.

Abstract

Ensaios de deslocamento da mobilidade electrof orética (EMSA) são uma ferramenta fundamental para caracterizar as interacções entre proteínas e suas sequências de ADN alvo. A radioactividade tem sido o método predominante de marcação de ADN em EMSAs. No entanto, avanços recentes em corantes fluorescentes e métodos de verificação ter solicitado o uso de marcação fluorescente de ADN como uma alternativa para radioactividade para as vantagens de fácil manuseamento, economia de tempo, reduzindo o custo, e melhorando a segurança. Nós temos usado recentemente EMSA fluorescente (Femsa) para tratar com sucesso uma questão biológica importante. Nossa análise FEMSA oferece uma visão mecanicista sobre o efeito de uma mutação missense, G73E, no altamente conservada fator de transcrição HMG SOX-2 no tipo de neurônio diversificação olfativo. Descobrimos que mutantes SOX-2 proteína ^G73E altera a atividade de ligação específica de DNA, causando transformação neurônio identidade olfativa. Aqui, apresentamos um otimizado e rentável passo-a-passo protocolopara FEMSA usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes e proteínas purificadas SOX-2 (WT e as proteínas mutantes ^G73E SOX-2) como um exemplo biológico.

Introduction

EMSAs são utilizados para a análise da interacção entre o ADN e as proteínas nativas usando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver uma mistura de uma proteína de interesse e uma sonda de ADN marcado contendo potenciais locais alvo da proteína ^1. Uma sonda de ADN ligado com proteína migrarão mais lenta em comparação com uma sonda de ADN livre, e é, por conseguinte, retardado na sua migração através de uma matriz de poliacrilamida. A radiomarcação de ADN por ³² P tem sido o método predominante para a detecção em EMSAs. Embora a aplicação de marcação radioactiva na pesquisa bioquímica tem sido benéfica, os métodos de rotulagem DNA alternativa com sensibilidade comparável estão sendo empregados devido aos riscos de saúde e segurança associados com a manipulação de radioatividade. Estes métodos alternativos incluem a conjugação de ADN com biotina ou digoxigenina ² (DIG) ³ (ambos os quais são então detectados por sistemas quimioluminescentes), SYBR verde de coloração dos géis página ^4,ou detecção direta de conjugados de corante de ADN fluorescente por digitalizar a ^5,6 gel.

Os géis resolvidos de EMSAs usando sondas de DNA marcadas radioactivamente requerem processamento postrun através de filmes auto-radiografia ou um sistema de phosphorimager para detectar sinais radioativos ^1,7. Géis de EMSAs utilizando biotina ou ^2-DIG conjugados com as sondas de ADN ³ também devem ser processados e transferidos para uma membrana adequada e, em seguida, detectados por quimioluminescência ^6. SYBR coloração verde do gel requer coloração de gel postrun e um scanner fluorescente ^4. Uma vez que as etapas de processamento de gel postrun são necessários para EMSAs utilizando estas técnicas de marcação de ADN, o gel pode ser resolvido ensaiados apenas uma vez. Em contraste, as sondas de ADN marcadas com fluoróforos pode ser detectada directamente no gel no interior das placas de vidro por um scanner. Portanto, as interacções ADN-proteína podem ser monitorizadas e ensaiado várias vezes a diferentes pontos de tempo durante a execução, quereduz significativamente o tempo e custo. Os conjugados de corante de ADN fluorescente que têm sido utilizados para EMSAs incluem ^6,8 Cy3, Cy5 ^{6,8, 9} fluoresceína, e corantes fluorescentes infravermelhos ^4-6.

A regulação transcricional requer interacções proteína-ADN de factores de transcrição e os seus genes-alvo. A coordenação dessas interações gera diversos tipos de células a partir de um antepassado comum durante o desenvolvimento animal. Uma frente tela genética não distorcida identificada uma mutação sem sentido, G73E, no domínio de ligação ao ADN de HMG altamente conservada do factor de transcrição de Caenorhabditis elegans SOX-2. Os resultados de mutação em uma transformação identidade da célula de AWB neurônios olfativos em AWC neurônios olfativos em níveis moleculares, morfológicos e funcionais ^5,10. SOX-2 diferencialmente regula a diferenciação terminal dos neurônios AWB e AWC, interagindo com fatores sócio de transcrição dependentes do contexto e respectivaLocais-alvo DNA ^5,10. SOX-2 parceiros com LIM-4 (LHX) no terminal de AWB diferenciação neuronal, enquanto SOX-2 parceiros com CEH-36 (OTX / DTA) na diferenciação neuronal AWC terminal. Ensaios de repórter de luciferase mostram que SOX-2 e da SOX-2 mutantes proteínas ^G73E ter interações de cooperação com co-factores de transcrição LIM-4 e CEH-36 para ativar um promotor expresso em neurônios AWB e AWC. No entanto, SOX-2 e mutante SOX-2 ^G73E exibido propriedades de activação diferencial do promotor. Para investigar a base molecular da actividade de ligação ao ADN diferenciais de SOX-2 e SOX-2 ^G73E, fEMSAs foram realizados com estas proteínas e os seus locais alvo potenciais.

Em primeiro lugar, uma abordagem foi feita bioinformática para identificar as sequências de ligação no interior da região promotora do 1 kb usado no ensaio de luciferase de ADN biologicamente relevante. Desde várias-2 SOX locais de ligação potenciais estavam presentes ao longo do promotor, nós nos concentramosem sítios de ligação de SOX-2 preditos adjacentes ao putativo CEH-36 ou LIM-4 locais de ligação e evolutivamente conservados entre várias espécies de nemátodos. Estas sequências foram excluídos ou mutado, e posteriormente testado in vivo para a sua actividade para expressar transgenes repórter GFP em neurónios AWB ou AWC. Através desta abordagem, identificou potenciais LIM-4 / SOX-2 e CEH-36-2 SOX locais alvo adjacentes / que são especificamente necessárias para a expressão de GFP em neurónios AWB AWC e ^5, respectivamente. Nós investigamos as diferenças potenciais no DNA ligação de SOX-2 e da SOX-2 ^G73E usando FEMSA com as CEH-36 / SOX-2 locais alvo adjacentes identificadas LIM-4 / SOX-2 e. Nossa análise EMSA mostraram que SOX-2 ^G73E não se ligou a sonda de DNA contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes (necessários para a expressão do gene em AWB) tão eficientemente quanto WT SOX-2 fez. No entanto, SOX-2 e da SOX-2 ^G73E não tinha diferença na ligação da sonda de DNA contendo o CEH-36 / SOX-2 umsite de destino djacent (necessária para a expressão de genes em AWC) ^5,10. O nosso femsa análises fornecem uma visão mecanicista para a natureza da mutação ^G73E SOX-2 em afectar a actividade de ligação do ADN específico para a transformação de células fenótipo identidade AWB-a-AWC. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado da Femsa usando 6xHis-SOX-2 purificadas ou 6xHis-SOX-2 ^G73E em conjunto com sondas de DNA marcadas com corante fluorescente no infravermelho contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes como estudo de caso para enfrentar uma importante questão biológica.

Protocol

NOTA: EMSAs usando sondas de DNA marcadas com fluorescência ou outras formas de ADN marcado partilham os mesmos protocolos para a preparação de proteína ou extracto celular, reacção de ligação proteína-ADN, e a preparação de gel de PAGE e execução (Figura 1A). As principais diferenças são procedimentos de ADN de rotulagem, etapas de processamento gel pós-run, e métodos de detecção. 1. Preparação do gel Prepare 5% de gel de poliacrilamida nativa contendo TBE 0,5x (…

Representative Results

Orange G corante de carga (6x: 0,12 g Laranja G em 100 ml de glicerol a 30%) pode ser adicionada à reacção de ligação antes do carregamento para visualizar o progresso da electroforese. Outros corantes de carga, incluindo azul de bromofenol vai ser detectadas durante a análise e, portanto, interferir com a análise de imagem (Figura 1B). Em alguns casos de EMSAs, especialmente se a preparação de extrac…

Discussion

fEMSAs são um instrumento eficaz para investigar interacções DNA-proteínas, e são uma alternativa à marcação radioactiva de ADN. corantes fluorescentes, tais como corantes de infravermelho estão comercialmente disponíveis, e proporcionar um método mais seguro e respeitador do ambiente em relação a marcação de ADN radioactivo. EMSAs usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante não requerem etapas de processamento gel postrun, e, portanto, economizar tempo e custo em comparaç…

Materials

30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides.  Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'–>5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred as a particular imaging software in the mansucript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA