kwantitatieve 3D<em> In Silico</em> Modeling (q3DISM) van cerebrale amyloid-beta Phagocytosis in diermodellen van de ziekte van Alzheimer
Summary
We ontwikkelden een methode voor kwantitatieve 3D in silico modellering (q3DISM) van cerebrale amyloid-β (Aß) fagocytose door mononucleaire fagocyten in diermodellen van de ziekte van Alzheimer. Deze methode kan worden gegeneraliseerd voor de kwantificering van vrijwel elke fagocytische gebeurtenis in vivo.
Abstract
Neuro-inflammatie wordt nu erkend als een belangrijke etiologische factor in neurodegeneratieve ziekte. Mononucleaire fagocyten zijn aangeboren immuunsysteem cellen die verantwoordelijk zijn voor de fagocytose en het ruimen van puin en afval. Deze cellen zijn onder andere CNS-resident macrofagen bekend als microglia en mononucleaire fagocyten infiltreren uit de periferie. Lichtmicroscopie over het algemeen gebruikt om fagocytose visualiseren knaagdieren of menselijke hersenen specimens. Echter kwalitatieve methoden geen definitief bewijs van in vivo fagocytose. Hier beschrijven we kwantitatieve 3D in silico modellering (q3DISM), een robuuste methode waardoor echte 3D-kwantificering van amyloid-β (Aß) fagocytose door mononucleaire fagocyten in knaagdieren de ziekte van Alzheimer (AD) modellen. De methode houdt fluorescerend visualiseren Ap ingekapseld in phagolysosomes inproefdierhersenen secties. Grote z-dimensionale confocale datasets worden vervolgens 3D gereconstrueerd voor kwantificering van A &# 946; ruimtelijk colocalized binnen de fagolysosoom. We tonen de succesvolle toepassing van q3DISM muizen- en ratten hersenen, maar deze methode kan worden uitgebreid tot vrijwel elke fagocytische gebeurtenis in elk weefsel.
Introduction
Ziekte van Alzheimer (AD), de meest voorkomende leeftijd gerelateerde dementie 1, gekenmerkt door cerebrale amyloïde-β (Aß) accumulatie "seniele" β-amyloïde plaques, chronische lage zenuwontsteking, tauopathie, neuronaal verlies en cognitieve stoornis 2 . In AD patiënt hersenen, wordt neuroinflammatie gereserveerd door reactieve astrocyten en mononucleaire fagocyten (aangeduid als microglia, hoewel hun centrale vs. perifere herkomst onduidelijk blijft) omliggende Aß afzettingen 3. Aangezien het aangeboren immuunsysteem wachters van het CZS, zijn microglia centraal gepositioneerd hersenen Aß wissen. Echter microglia werving Ap-plaques gepaard met zeer weinig of geen Aß fagocytose 4,5. Een hypothese is dat microglia in eerste instantie neuroprotectieve door phagocytozing kleine vergaderingen van AB. Echter, uiteindelijk deze cellen neurotoxisch overweldigend Aß last en / of leeftijdsgerelateerde functionele decline, provoceert microglia in een disfunctionele pro-inflammatoire fenotype, wat bijdraagt aan neurotoxiciteit en cognitieve achteruitgang 6.
Recente Genoombrede Association Studies (GWAS) hebben een cluster van AD risico-allelen die behoren tot de belangrijkste aangeboren immuunsysteem trajecten 7 dat fagocytose 8-11 moduleren geïdentificeerd. Bijgevolg, de immuunrespons op cerebrale amyloïde afzetting is uitgegroeid tot een belangrijk aandachtsgebied, zowel in termen van het begrip van AD etiologie en voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen 12-14. Toch is er een belangrijke behoefte aan methoden Ap fagocytose in vivo te evalueren. Om dit onvervulde behoefte aan te pakken, hebben we kwantitatieve 3D in silico modellering (q3DISM) naar echte 3D-kwantificering van cerebrale Ap fagocytose door mononucleaire fagocyten in knaagdier modellen van Alzheimer-achtige ziekte in te schakelen ontwikkeld.
alleen beperkt door de mate waarin zij recapituleren ziekte, dierlijke modellen hebbenbewezen van onschatbare waarde voor het begrijpen van AD pathoetiology en voor het evalueren van experimentele therapieën. Vanwege het feit dat mutaties in de preseniline (PS) en Amyloid Precursor Protein (APP) genen onafhankelijk veroorzaken autosomaal dominante AD, zijn deze mutant transgenen uitgebreid toegepast om transgene knaagdiermodellen genereren. Transgene APP / PS1 muizen gelijktijdig co-expressie "Swedish" mutant menselijk APP (APP swe) en Δ exon 9 mutant menselijk preseniline 1 (PS1ΔE9) aanwezig met versnelde cerebrale amyloïdose en neuroinflammatie 15,16. Verder hebben we bi-transgene ratten gecoïnjecteerd met APP swe en PS1ΔE9 constructies (lijn TgF344-AD, op een Fischer 344 achtergrond) gegenereerd. In tegenstelling tot transgene muismodellen van cerebrale amyloïdose, TgF344-AD ratten ontwikkelen van cerebrale amyloïde dat tauopathie, apoptotische verlies van neuronen, en gedragsmatige impairment 17 voorafgaat.
In dit rapport beschrijven we een protocol voor immunostaining microglia, phagolysosomes en Ap-afzettingen in de hersenen secties van APP / PS1 muizen en TgF344-AD ratten, en de verwerving van grote z-dimensionale confocale beelden. We detail in silico generatie en analyse van de echte 3D-reconstructies van confocale datasets waardoor kwantificering van Ap-opname in microglia phagolysosomes. Meer in het algemeen, kan de methodologie die detail Here We worden gebruikt om vrijwel elke vorm van fagocytose in vivo te kwantificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat we beschrijven in dit verslag voor echte 3D-kwantificering van Ap fagocytose in vivo door mononucleaire fagocyten steunt op specifieke etikettering van cellulaire en subcellulaire compartimenten evenals Ap-deposito's. Specifiek gebruiken we Iba1 (geïoniseerd-calcium bindende adapter molecuul 1), een eiwit dat betrokken is bij membraan roffelende en fagocytose na celactivering 18, 19, cerebrale mononucleaire fagocyten vlekken. Terwijl Iba1 + celle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Materials
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
| Tweezers | VWR | 94024-408 | |
| 23G needle | VWR | BD305145 | |
| peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
| Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
| Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
| Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
| Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
| Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
| Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
| rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
| Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
| Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
| OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
| Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
| Immersion oil | Nikon | ||
| A1 Confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
| Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |
References
- Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer’s disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
- Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer’s disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
- Mawuenyega, , et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer’s disease. Science. 330 (6012), 1774 (2010).
- Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer’s disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
- Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer’s disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
- Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer’s disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
- Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
- Hazrati, L. -. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer’s disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949 (2012).
- Griciuc, A., et al. Alzheimer’s Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
- Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer’s disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
- Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: “Its All About Context”. Int J Alzheimers Dis. , 314185 (2012).
- Guillot-Sestier, M. -. V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer’s Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
- Guillot-Sestier, M. -. V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer’s disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
- Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
- Guillot-Sestier, M. -. V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
- Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
- Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer’s disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer’s disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
- Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
- Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
- Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33 (2015).
- Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46 (2014).
- Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer’s disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
- Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
- Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -. A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer’s Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
- Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
- Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).
