Индуцибельные LAP-меченый Стабильные клеточные линии для исследования белка функции, пространственно-временной локализации и белковое взаимодействие сетей

Summary

We describe a method for generating localization and affinity purification (LAP)-tagged inducible stable cell lines for investigating protein function, spatiotemporal subcellular localization and protein-protein interaction networks.

Abstract

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this principle, the purification of critical proteins required for the functioning of these pathways along with their native interacting partners has not only allowed the mapping of the protein constituents of these pathways, but has also provided a deeper understanding of how these proteins coordinate to regulate these pathways. Within this context, understanding a protein’s spatiotemporal localization and its protein-protein interaction network can aid in defining its role within a pathway, as well as how its misregulation may lead to disease pathogenesis. To address this need, several approaches for protein purification such as tandem affinity purification (TAP) and localization and affinity purification (LAP) have been designed and used successfully. Nevertheless, in order to apply these approaches to pathway-scale proteomic analyses, these strategies must be supplemented with modern technological developments in cloning and mammalian stable cell line generation. Here, we describe a method for generating LAP-tagged human inducible stable cell lines for investigating protein subcellular localization and protein-protein interaction networks. This approach has been successfully applied to the dissection of multiple cellular pathways including cell division and is compatible with high-throughput proteomic analyses.

Introduction

To investigate the cellular function of an uncharacterized protein it is important to determine its in vivo spatiotemporal subcellular localization and its interacting protein partners. Traditionally, single and tandem epitope tags fused to the N or C-terminus of a protein of interest have been used to facilitate protein localization and protein interaction studies. For example, the tandem affinity purification (TAP) technology has enabled the isolation of native protein complexes, even those that are in low abundance, in both yeast and mammalian cell lines^1,2. The localization and affinity purification (LAP) technology, is a more recent development that modifies the TAP procedure to include a localization component through the introduction of the green fluorescent protein (GFP) as one of the epitope tags³. This approach has given researchers a deeper understanding of a protein’s subcellular localization in living cells while also retaining the ability to perform TAP complex purifications to map protein-protein interaction networks.

However, there are many issues associated with the use of TAP/LAP technologies that has hampered their widespread use in mammalian cells. For example, the length of time that is necessary to generate a stable cell line expressing a TAP/LAP tagged protein of interest; which typically relies on cloning the gene of interest into a viral vector and selecting single cell stable integrants with the desired expression level. Additionally, many cellular pathways are sensitive to constitutive protein overexpression (even at low levels) and can arrest cells or trigger cell death over time making the generation of a TAP/LAP stable cell line impossible. These and other constraints have impeded LAP/TAP methodologies from becoming high-throughput systems for protein localization and protein complex elucidation. Therefore, there has been considerable interest in the development of an inducible high-throughput LAP-tagging system for mammalian cells that takes advantage of current innovations in cloning and cell line technologies.

Here we present a protocol for generating stable cell lines with Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet) inducible LAP-tagged proteins of interest that applies advances in both cloning and mammalian cell line technologies. This approach streamlines the acquisition of data with regards to LAP-tagged protein subcellular localization, protein complex purification and identification of interacting proteins⁴. Although affinity proteomics utilizes a wide range of techniques for protein complex elucidation⁵, our approach is beneficial for expediting the identification of these complexes and their native interaction networks and is amenable to high-throughput protein tagging that is necessary to investigate complex biological pathways that contain a multitude of protein constituents. Key to this approach are advancements in cloning strategies that enable high fidelity and expedited cloning of target genes into an array of vectors for gene expression in vitro, in various organisms like bacteria and baculovirus, and in mammalian cells^6,7. Additionally, the ORFeome collaboration has cloned thousands of sequence validated open reading frames in vectors that incorporate these advances in cloning, which are available to the scientific community^8-11. In our system, the pGLAP1 LAP-tagging vector enables the simultaneous cloning of a large number of clones, which facilitates high-throughput LAP-tagging. This expedited cloning procedure is coupled to a streamlined approach for generating cell lines with LAP-tagged genes of interest inserted at a single pre-determined genomic locus. This makes use of cell lines that contain a single flippase recognition target (FRT) site within their genome, which is the site of integration for LAP-tagged genes. These cell lines also express the tetracycline repressor (TetR) that binds to Tet operators (TetO₂) upstream of the LAP-tagged genes and silences their expression in the absence of Dox/Tet. This allows for Dox/Tet inducible expression of the LAP-tagged protein at any given time. Having the capability of inducible LAP-tagged protein expression is critical, since many cellular pathways are sensitive to the levels of critical proteins governing the pathway and can arrest cell growth or trigger cell death when these proteins are constitutively overexpressed, even at low levels, making the generation of non-inducible LAP-tagged stable cell lines impossible¹².

Protocol

Примечание: обзор генерации индуцируемых LAP-меченый линии клеток стабильным для любого интересующего белка иллюстрируется на рисунке 1 и обзор LAP-меченого экспрессии белка, очистки и подготовки к массовым протеомики анализа показан на рисунке 3. 1. Клонирование открытой рамки считывания (ORF) гена интереса в LAP-тегов Вектор Клонирование ORF гена интереса к челночной Vector. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации ORF интереса с соответствующими attB1 и attB2 сайтов в пределах праймеров для любого N-концевого слияния или С-концевого слияния. Приведены в таблице 1 для последовательностей праймеров и таблице 2 для условий ПЦР. Гель очищают продуктов ПЦР путем разделения их на 1% -ном агарозном геле. Акцизный усиленную группу, которая является правильный размер из геля и извлечь его из куска геля с использованием ДНК гнабор для выделения эль в соответствии с инструкциями изготовителя. Выдержите очищенный attB , содержащий продукты ПЦР с ATTP , содержащим челночный вектор и рекомбиназы , что позволяет ПЦР – продукты рекомбинация в вектор в соответствии с инструкциями производителя (см M aterials таблицу). Примечание: Пустые челночные векторы и LAP-мечения векторы содержат ген ПЗС- B и должны быть размножены в ПЗС- В устойчивых бактериальных клеток (см Материалы таблицу). Однако ген БДКК объединяется, когда к ней ORF вставляется в эти векторы, следовательно , используют стандартные клетки DH5 & alpha ; E.coli , при распространении векторов с клонированными ORF , . Transform DH5 & alpha ; клетках E.coli с 1 мкл продукта реакции и пластинчатые трансформированных клеток на Лурии бульона (LB) агар пластины с 50 мг / мл канамицина 13. Выберите колонии, устойчивые к канамицину. Grow выбранные колонии в LB меняДиа с 50 мг / мл канамицина, чтобы ДНК мини-Prep и подтвердить интеграцию гена путем секвенирования ДНК с использованием праймеров для секвенирования , перечисленных в таблице 3. Перенос интересующего гена из челнока Вектор в LAP-тега Vector. Выдержите челночный вектор, содержащий последовательность подтверждали интересующего гена ORF с LAP-тегов вектора (pGLAP1 для N-концевого слитого) и рекомбиназы, который опосредует передачу представляющего интерес гена из челночного вектора в вектор LAP-тегов в соответствии с инструкции изготовителя (см Материалы). Примечание: Серия LAP / TAP векторов , которые могут быть использованы на основе желаемой промотора, эпитоп-метку, и N или С-концевого мечения можно найти в таблице 4. Transform DH5 & alpha ; клетках E.coli с 1 мкл продукта реакции и пластинчатые трансформированных клеток на чашку с агаром LB с 100 мг / мл ампициллина , 13. Выберите стойкую Colo ампициллинпаний. Grow выбранные колонии в LB среде с 100 мг / мл ампициллина, сделать ДНК мини-Prep, и подтвердить интеграцию гена путем секвенирования ДНК с использованием праймеров , перечисленных секвенирования в таблице 5. 2. Генерация индуцируемого стабильной клеточной линии, которая выражает LAP-меченый ген, представляющий интерес Выберите линию клеток лучше всего подходит для проекта, представляющего интерес. В качестве альтернативы, создать линию клеток хозяина из любой существующей линии клеток, которые конститутивно экспрессирует тетр и содержит сайт FRT, который позволяет Поясной-меченый ген, представляющий интерес быть стабильно интегрирована в геном (см Материалы). Примечание: Этот протокол использует клеточной линии HEK293, содержащий тетр и сайт FRT, выращиваемый в -Tet DMEM / F12 СМИ [сделано с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), лишенной тетрациклин (-Tet)] 4 , Определить минимальную концентрацию гигромицина требуется, чтобы убить линию клеток-хозяев в пределах от 1 до 2 пикс после того наркотиков. Концентрация может варьироваться от линий клеток-хозяев, при этом большинство в диапазоне от 100 мкг / мл и 800 мкг / мл. Примечание: HEK293 клетки , выращенные в -Tet DMEM / F12 среде с 100 мкг / мл гигромицину , при температуре 37 ° С и 5% СО 2 умирают в течение 1-2 недель. Со-трансфекцию вектора, выражающий флиппазы рекомбиназой (посредничает интеграцию LAP-меченого интересующего гена в сайт FRT внутри генома клетки) с вектором LAP-меченый в клетки HEK293 с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя , Используйте соотношение 4: 1 рекомбинантному вектора к вектору LAP 14. Примечание: Оптимальное соотношение зависит от линии клетки-хозяина и способ трансфекции, и может потребоваться титрование. Соотношение 4: 1 хорошо подходит для большинства клеточных линий. Включите мнимо трансформированных пластину в качестве отрицательного контроля. Однажды после трансфекции, замените / F12 СМИ -Tet DMEM со свежей средой. Через два дня после transfectiна, расщепленных клеток до 25% слияния. Разрешить клетки ~ 5 ч, чтобы прикрепить к нему, а затем добавить к гигромицину-содержащий -Tet DMEM / F12 носитель в концентрации заданного в шаге 2.2. Для НЕК293 используют 100 мкг / мл к гигромицину. Примечание: FRT содержащий клеточной линии HEK293 также содержит тетр, связанный с сопротивлением бластицидин, поэтому 5 мкг / мл бластицидин используется во время стабильного процесса отбора клеточной линии, чтобы выбрать для тетр и свести к минимуму вытекающей выражение. Заменить гигромицину содержащих -Tet DMEM / F12 СМИ по мере необходимости, пока отдельные очаги клеток появляются, которые напоминают непрозрачных пятен на прозрачной пластине. Добавьте 20 мкл трипсина в верхней части каждой ячейки очагов и пипеткой вверх и вниз в 2 раза с 200 мкл пипетки наконечник. Место клеток в 24-луночного планшета и расширить клетки путем непрерывного роста в гигромицину содержащих -Tet DMEM / F12 СМИ. Клетки сетчатые для индуцируемой экспрессии белка LAP-меченый по фиксированной клеток или живых клеток флуоресцентной микроскопии и / илиВестерн – блоттинга для GFP тега внутри тега LAP-15. 3. Очистка LAP-меченый белковых комплексов Примечание: Следующая LAP-меченого очистки белков детали протокола рекомендации по условиям и объемам используемых для типичной очистки белков LAP-меченый на основе предыдущего опыта. Тем не менее, следует проявлять осторожность, чтобы гарантировать, что эмпирическое оптимизация проводится для любого белкового комплекса и уровня экспрессии белка, представляющие интерес для обеспечения наилучших результатов. Рост клеток и клеток урожая. Разверните проверенную LAP-меченый клеточной линией для TAP изоляции белковых комплексов, путем непрерывного пассирования все НЕК293 в более крупные пластин и / или роллер – флаконах в -Tet DMEM / F12 среде при температуре 37 ° С и 5% CO 2. Для индуцибельная клеточных линий Tet / Dox, индуцируют в течение 10-15 ч при концентрации 0,2 мкг / мл Tet / Dox, когда клетки достигают ~ 70% слияния, до того harvestinг клеток. Примечание: Концентрация и время индукции должен быть определен для каждого белка, титрование 0,1-1 мкг / мл Tet / Dox в течение 10-15 ч, рекомендуется. Урожай клеток путем перемешивания или трипсином и гранул клеток при 875 мкг в течение 5-10 мин. Связывание анти-GFP антитела к Бисер Белок А С помощью 40 мкг антитела для иммунопреципитации из лизатов, приготовленной из 0,5 мл клеточного осадка с, гематокрита (PCV). Примечание: Количество антитела, необходимое будет зависеть от обилия LAP-меченый белок, наряду с другими факторами, и потребует оптимизации. Титрование 10-40 мкг рекомендуется. Равновесие 160 мкл объем уплотненного (PV) бусинки Белок A в PBST (PBS + 0,1% твин-20) в 1,5 мл трубки. Промыть 3 раза с 1 мл PBST. ПРИМЕЧАНИЕ: Все смывает в настоящем документе, осуществляют центрифугирование бусинки при 5000 мкг в течение 10 сек. Ресуспендируют бисером в 500 мкл PBST и добавляют 80 мкг сродства-purified кроличьей анти-GFP антитела в каждую пробирку 160 мкл бус. Перемешивайте в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Вымойте бисером 2 раза с 1 мл PBST. Затем мыть бусин в 2 раза с 1 мл 0,2 М бората натрия, рН 9 (20 мл 0,2 М бората натрия + 15 мл 0,2 М борной кислоты). После последней промывки, добавляют 900 мкл 0,2 М бората натрия, рН 9, чтобы довести до конечного объема 1 мл. Добавьте 100 мкл 220 мМ диметилпимелимидата (DMP) до конечной концентрации 20 мМ. Поворот пробирки осторожно при комнатной температуре в течение 30 мин. Для получения 220 мМ DMP, ресуспендирования содержимое одного флакона 50 мг в 877 мкл 0,2 М бората натрия, рН 9 и добавляют непосредственно к суспензионной. После инкубации с ДМП, мыть бусин 1 раз с 1 мл 0.2 М этаноламина, 0,2 М NaCl, рН 8,5, чтобы инактивировать остаточный сшивающий агент. Ресуспендируют бисером в 1 мл того же буфера и вращаются в течение 1 ч при комнатной температуре. Пелле шарики и ресуспендируют бусины в 500 мкл 0,2 М этаноламина, 0,2 М NaCl с рН 8,5. Бусинки стабильны в течение Северал месяцев при температуре 4 ° С. Подготовка буфера для лизиса клеток и комплексной очистки Подготовьте LAPX буферов (где X является искомой концентрации соли [мМ KCl] буфера LAP; 300 мм для лизиса клеток, 200 мм для большинства бортов моек, и 100 мм для мытья шариков до начала элюирование белков) путем рН раствора 7,4 содержащий 50 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), Х мМ КСl, 1 мМ этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EGTA), 1 мМ MgCl 2, и 10% глицерина. Примечание: Компоненты этого буфера используются для аппроксимации среды в живых клетках. HEPES используется в качестве буфера в рН ярости 7.2-8.2. KCl, соль, используемая для поддержания ионной силы буфера. EGTA является хелатирующий агент, который связывает ионы кальция, чтобы уменьшить уровень кальция по сравнению с магнием. Глицерин и MgCl 2 используются для улучшения стабильности белков. Подготовьте LAPX N буфер добавлением 0,05% нонил phenoxypolyethoxylethanol в буфер LAPX. Примечание: нонил phenoxypolyethoxylethanol является мягкое моющее средство, что растворяет белки, но сохраняет белок-белковых взаимодействий, таким образом, используется более высокая концентрация в процессе экстракции и затем опускается во время связывания и промывки. Получение клеточных лизатов Ресуспендируют в 500 мкл PCV в 2,5 мл LAP300 с 0,5 мМ дитиотреитола (DTT) и ингибиторы протеазы. Добавить 90 мкл 10% нонил phenoxypolyethoxylethanol (0,3%) и окончательным перемешайте инверсии. Место на льду в течение 10 мин. Центрифуга при 21000 х г в течение 10 мин. Собрать эту низкую скорость супернатант (LSS). Возьмите пробу 10 мкл для анализа LSS геля. Передача LSS в TLA100.3 трубки и спина при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Соберите эту высокую скорость супернатанта (HSS), в трубе и место на льду. Возьмите пробу 10 мкл HSS для анализа в геле. Примечание: Избегайте брать верхний слой наиболее липидный апd нижней ячейки мусора слой. Липидный слой должен быть удален путем вакуумной аспирации до сбора ССА. Первый Affinity Capture: Связывание с бисером Anti-GFP Предварительно элюирования антитела в сочетании бусин (используют 160 мкл шариков на 0,5 мл клеточного осадка (PCV)) путем промывки их 3 раза 1 мл буфера для элюции [3,5 М MgCl 2 20 мМ Трис, рН 7,4] , чтобы избавиться от отцеплен антитела и уменьшить фон. Сделайте быстро. Не оставляйте шарики в высокой концентрации соли в течение длительного времени. Вымойте бисер 3 раза 1 мл LAP200 N. Смешайте HSS экстракт с бусами антителами в течение 1 ч при температуре 4 ° С. Центрифуга при 21000 х г в течение 10 мин. Возьмите пробу 10 мкл супернатанта (то есть поток , проходящий через (FT)) для анализа в геле. Промыть бусин 3 раза с помощью 1 мл LAP200 N с 0,5 мМ ДТТ ингибиторов и протеаз. Вымойте бисером 2 раза (5 мин каждая) с 1 мл LAP200 N с 0,5 мМ DTT ингибиторов и протеазы. Промыть быстро 2 тредакторы IME с 1 мл LAP200 N с 0,5 мМ DTT и без каких – либо ингибиторов протеазы перед добавлением вируса табака травление (ТРВ) протеазы. ТРВ Расщепление Разбавляют 10 мкг TEV протеазы в 1 мл LAP200 N и вращать трубки при 4 ° С в течение ночи. Примечание: Этот шаг может быть оптимизирована для любого LAP-меченый белок должен быть завершен в течение нескольких часов, регулируя концентрацию TEV протеазы, который может помочь сохранению LAP-меченого белковых комплексов. Гранул шарики и передачи супернатант в свежую пробирку. Промыть шарики дважды 160 мкл LAP200 N с 0,5 мМ DTT и ингибиторы протеазы (тройной концентрации) , чтобы удалить остатки белка. Возьмите пробу 10 мкл супернатанта для анализа в геле. Второй Affinity Capture: Связывание с S белка агарозном Промыть 1 тюбик 80 мкл S белка агарозном суспензии (40 мкл упакована смола) 3 раза с помощью 1 мл LAP200 N. Примечание: S ProtEin связывание с S-тега будет воссоздавать активную РНКазы и альтернативный второй эпитоп тег следует рассматривать для РНК-содержащие белковые комплексы. Добавить ТРВ элюируют супернатант S белка агарозном бусин и рок в течение 3 ч при температуре 4 ° С. Пелле шарики и промыть 3 раза с 1 мл LAP200 N с 0,5 мМ DTT ингибиторов и протеазы. Вымойте бисером 2 раза с 1 мл LAP100. Белок Элюирование Элюции белки от S белок агарозы путем добавления 50 мкл 4х буфера Лэммли образца и нагревают при 97 ° С в течение 10 мин. Примечание: Белки также могут быть элюировали из бисера с буфера для элюции (3,5 М MgCl 2 20 мМ Трис, рН 7,4). 4. Выявление белков, взаимодействующих с помощью масс-спектрометрического анализа Проверить качество очистки путем анализа собранных образцов электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), окрашивание серебром геля (см <stronг> Материалы таблицу) и иммуноблоттинга элюатов и исследование с анти-GFP антител , чтобы обеспечить очистку Поясной-меченый работали 16 см Рисунок 4. Для того, чтобы определить стехиометрические и субстехиометрические видов со-очистительные, принять окончательное образец элюции и отделить его с помощью SDS-PAGE. Пятно гель с масс-спектрометрии совместимы белка пятна. Акцизный самые известные группы и пространство между ними из геля и обрабатывать их для анализа методом масс – спектрометрии отдельно 16. Примечание: Существуют многочисленные подходы для разделения конечных элюатов очистки и подготовки их для масс – спектрометрии 5. Например, LAP-очищенные комплексы могут быть элюировали из S-белка с помощью бус с высоким содержанием соли (3,5 М MgCl 2) и все население белка скопом можно анализировать с помощью масс – спектрометрии 17. В качестве альтернативы, конечные элюатов могут быть разделены на 1 мм с помощью SDS-PAGE и один 1 мм полоса может быть электроннойxcised и проанализированы. Это очищает сложную смесь любых гранул или частиц, которые будут мешать анализу.

Representative Results

Для того, чтобы подчеркнуть полезность этой системы, открытой рамки считывания (ORF) , связывающего белка тау микротрубочек клонировали в челночный вектор путем амплификации Tau ORF с использованием праймеров , содержащих attB1 и attB2 участки (таблица 1) , и инкубацию продуктов ПЦР с помощью челночный вектор и рекомбиназа, который опосредует вставки ПЦР-продуктов в челночный вектор. Продукты реакции использовали для трансформации DH5 & alpha ; бактерии 13 и плазмидной ДНК из колоний , устойчивых к канамицину был секвенирован , чтобы обеспечить вставку тау. Последовательность подтверждено шатл-тау вектор был затем использован для передачи Tau ORF в вектор pGLAP1, который плавленого Tau в рамке с LAP (EGFP-ТРВ-S-белка) тегов, путем инкубирования челночный вектор-тау с вектором pGLAP1 и рекомбиназа, который опосредует передачу ORF из челночного вектора до pGLAP1. Продукты реакции использовали для трансформации DH5 & alpha; бактерии13 и плазмидной ДНК из колоний , устойчивых к ампициллину , секвенировали , чтобы гарантировать , что слитый LAP-тау был в кадре. Последовательность подтверждено pGLAP1-LAP-Tau затем котрансфицируют с вектором, выражающего флиппазы рекомбинации фермента в клетках НЕК293, содержащий мишень одного распознавания флиппазы (FRT) сайта в их геном, который является местом интеграции для LAP-меченый генов 14. Эта клеточная линия также выразил тетр, который связывается с операторами Tet перед Поясной-меченый генов и заглушает их экспрессию в отсутствие Tet / Dox. Стабильные интегранты были выбраны с -Tet DMEM / F12 среде с 100 мкг / мл гигромицина в течение 5 дней. Отдельные гигромицину, фокусы устойчивые клеточные собирали путем добавления 20 мкл трипсина на верхней и пипетированием вверх и вниз 2 раза. Клетки были помещены в 24-луночный планшет и расширена за счет непрерывного роста в -Tet DMEM / F12 средах. Для того, чтобы проверить, что клетки резистентной к гигромицинуs были способны выражать LAP-тау, HEK293 LAP-Tau клетки индуцируют 0,1 мкг / мл Dox в течение 15 ч и белковые экстракты получают из неиндуцированной и DOX-индуцированных клеток. Эти экстракты разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на PVDF-мембрану и иммуноблоттинг для GFP и тубулина в качестве контроля нагрузки. Как видно на рисунке 4A, LAP-тау (визуализировали с помощью анти-GFP антител) была выражена только в присутствии Dox. Для того, чтобы подтвердить , что LAP-тау был должным образом локализованы в митотических микротрубочек веретена в митозе, как это было ранее показано на эндогенный Tau 18, клетки НЕК293 LAP-тау индуцировали с помощью 0,1 мкг / мл Dox в течение 15 часов и клетки фиксировали 4% параформальдегидную совместно окрашивали ДНК (Hoechst 33342) и микротрубочек (анти-тубулина антителами). Последовательно, LAP-тау был локализован в митотического веретена во время метафазы митоза (рис 4В). Для того, чтобы убедиться, что LAP-Тау и ее взаимодействующих белков может быть очищен с этим SYSTEM, НЕК293 LAP-Tau-клетки культивируют в роллер-флаконах до ~ 70% сплошности, индуцированный с 0,1 мкг / мл Dox в течение 15 часов, собирали путем перемешивания, лизируют с буфером LAP300, и LAP-тау был очищен с использованием вышеуказанного протокола. Элюаты от очистки LAP-тау были решены с помощью SDS-PAGE и гель окрашивали серебра. Рисунок 4C показывает очистку LAP-тау, отмеченные звездочкой является LAP-тау и несколько других групп свидетельствуют о Tau взаимодействующих белков можно увидеть. Рисунок 1: Обзор поколения LAP-меченый Индуцибельные Стабильные клеточные линии для любого интересующего белка. Открытая рамка считывания (ORF), из представляющих интерес генов амплифицируют с attB1 и attB2 сайтов, фланкирующих 5'- и 3'-конец последовательности, соответственно (последовательности праймеров приведены в Таблица 1) и клонировали в шаттл вектор. Последовательность проверяли челночные векторы с интересующим геном, затем используются для передачи интересующего гена в вектор pGLAP1. Последовательность проверяли pGLAP1 вектор с интересующего гена затем котрансфицируют с вектором, содержащим флиппазы рекомбиназу в желаемую клеточную линию, которая содержит цель одного распознавания флиппазы (FRT) сайта в их геном, который является местом интеграции для LAP -tagged генов. Эти клеточные линии также выражают Tet репрессор (тетр) , который связывается с операторами Tet (Teto 2) вверх по течению от LAP-меченый генов и заглушает их экспрессию в отсутствие Tet / Dox. Поясной-меченый интерес ген затем рекомбинируют в сайт FRT и стабильные интегранты выбираются с использованием гигромицина. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/> Рисунок 2: Обзор приложений для LAP-меченый стабильных клеточных линий. LAP-меченый индуцируемые стабильные клеточные линии, которые индуцируют экспрессию Поясной-меченый белок, представляющий интерес путем Dox добавления и может быть синхронизирована на разных стадиях клеточного цикла или могут быть стимулированы с химическими веществами или лигандами, чтобы активировать любой желаемой пути передачи сигнала. Субклеточном локализации LAP-меченого белка, представляющего интерес можно анализировать с помощью живой клетки или визуализации фиксированной ячейки. LAP-меченных белков также может быть тандем аффинно очищенные и взаимодействующими белки могут быть идентифицированы с помощью жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS). И, наконец, Cytoscape может быть использован для создания сети белок-белковое взаимодействие белка приманки. Dox указывает доксициклина, IP указывает иммунопреципитации, EGFP указывает на усиленный зеленый флуоресцентный белок, Тев указывает сайт расщепления TEV протеазы, а S обозначает S-тег.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3: Обзор LAP-меченый экспрессии белка, очистки и подготовки к масс – спектрометрии. Протокол состоит из 9 этапов: 1) рост и индукции экспрессии белка LAP-меченый, 2) сбор клеток и лизис, 3) подготовка лизатов, 4) связывание лизатов с анти-GFP бусин, 5) TEV протеазы расщепление GFP-тег, 6) связывание лизатов с S-белковых шариков, 7) вымывание белка приманки и взаимодействующих белков и 8-9) подготовки образцов для масс-спектрометрии на основе протеомных анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. </p> Рисунок 4: Проверка экспрессии LAP-тау. (A) Вестерн – блот (ВБ) Анализ образцов белка из неиндуцированной и Dox индуцированных клеток LAP-тау НЕК293 зондировали с анти-GFP и анти-тубулина антител для обнаружения LAP-меченый тау – белка и контроль Tubulin нагрузки, соответственно. Обратите внимание, что LAP-тау выражается только тогда, когда клетки индуцировали Dox. Клетки (B) митоза , выражающие LAP-Tau фиксировали и окрашивали совместно для ДНК (Hoechst 33342) и тубулина (ванна) с анти-тубулина антителами и субклеточном локализации LAP-тау анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Обратите внимание, что LAP-тау локализуется в митотического веретена и шпинделя полюсов во время митоза. (C) Серебро окрашивали гель очистки LAP-тау. MW обозначает молекулярную массу, CL показывает освобоженные лизатов и Е INDICATES окончательные элюатов. Образцы прогоняли на 4-20% SDS-PAGE, и гель окрашивали серебро, чтобы визуализировать очищенные протеины. Обратите внимание, что полоса, соответствующая LAP-тау отмечен звездочкой и ряда других полос, соответствующих совместно очистки белков можно увидеть. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. N-концевой слитый Вперед 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG – (> 18gsn) -3 ' Задний ход 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA – (> 18gsn) -3 ' C-концевой слитый Вперед 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC – (> 18gsn) -3 ' Задний ход 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G – (> 18gsn) -3 ' Таблица 1: прямого и обратного праймеров для амплификации ORF , или интереса для вставки в Shuttle Vector. Участки attB выделены жирным шрифтом, GSN означает, что более чем 18 генов специфические нуклеотиды добавляются к грунтовке. шаг температура Время Первоначальная денатурация 94 ° C 2 мин Циклы ПЦР-амплификации (35) денатурировать 94 ° C 30 сек отжигать 55 ° C (в зависимости от праймера Tm) 30 сек простираться 72 ° C 1 мин / кб Держать 4 ° C на неопределенное время Таблица 2: условия ПЦР для амплификации ORF , представляющих интерес. Вектор Форвард Секвенирование Primer Обратный секвенирования Primer Трансфер Вектор 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' Таблица 3: в прямом и обратном праймеры для секвенирования для Shuttle Vector. Я БЫ Состав родительский Промоутер Bac Res Мам Res Tet рег? pGLAP1 N-термин EGFP-ТРВ-S пептид pcDNA5 / FRT / TO ЦМВ ампер Hyg да pGLAP2 N-термин Flag-ТРВ-S пептид pcDNA5 / FRT / TO ЦМВ ампер Hyg да pGLAP3 N-термин EGFP-ТРВ-S пептид; C перспективе V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a ампер Hyg Нет pGLAP4 N-термин Flag-ТРВ-S пептид; ; C перспективе V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a <td> Amp Hyg Нет pGLAP5 C-S Термин пептид-PreProt x2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a ампер Hyg Нет Таблица 4: Список доступных LAP / TAP векторов с переменными промоутеры, эпитоп-теги и Dox индуцируемой экспрессии Возможности для N или С-концевого белка Tagging. Векторы являются коммерчески доступными. Bac Res указывает маркер устойчивости к бактериальным, Мам Res указывает маркер устойчивости клеток млекопитающих, Tet рег? указывает, является ли выражение Tet / Dox регулируемую. Вектор Форвард Секвенирование Primer Обратный секвенирования Primer pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' Таблица 5: в прямом и обратном праймеры для секвенирования для pGLAP векторов.

Discussion

Изложенная протокол описывает клонирование генов, представляющих интерес в вектор LAP-маркировать, поколение индуцируемых LAP-меченый стабильных клеточных линий, а также очистку LAP-меченый белковых комплексов для протеомных анализов. Что касается других подходов LAP / TAP-мечения, этот протокол был оптимизирован, чтобы быть совместимым с высокой пропускной способностью подходов к карте локализации белка и белок-белковых взаимодействий в пределах любого клеточного пути. Такой подход широко применяется к функциональной характеристике белков критических для прогрессии клеточного цикла, сборки веретена, шпинделя полюса гомеостаза и цилиогенеза назвать несколько и помог понять, как misregulation этих белков может привести к человеческим заболеваниям ^{15, 16,19,20.} Например, наша группа недавно использовали эту систему для определения функции и регуляции STARD9 митотической кинезином (целевая рак кандидат) в сборке шпинделя ^15,21, чтобы определитьНовая молекулярная связь между Tctex1d2 динеин легкой цепи и короткие ребра полидактилия синдромы (SRPS) ^19, и определить новую молекулярную связь для понимания того, как мутация убиквитинлигазы MID2 может привести к Х-хромосомой ограниченными интеллектуальными возможностями ^16. Другие лаборатории также успешно применили этот метод, в том числе тот , который определил , что Tctn1, регулятор мыши Hedgehog сигнализации, была частью цилиопатии ассоциированного белкового комплекса , которая регулировала цилиарного состава мембраны и цилиогенеза в ткани-зависимым способом ^22,23. Таким образом, этот протокол может быть широко применен к рассечения любого клеточного пути.

Важным шагом в этом протоколе является выбор LAP-меченый стабильных клеточных линий, которые являются устойчивыми к гигромицину. Особое внимание следует уделять внимание тому, чтобы все клетки в контрольной пластине мертвы, прежде чем выбрать фокусы в экспериментальной пластины для усиления. Гигромицину также может быть ADDEd во время обычного клеточного культивирования LAP-меченый линии клеток стабильным для дальнейшего обеспечения того, чтобы все клетки поддерживать LAP-меченый интересующего гена на сайте FRT. Мы предупреждаем, что не все LAP-меченных белков будет функциональным и, что важно иметь анализы на месте, которые могут быть использованы для тестирования функции белка. Примеры анализов , используемых для тестирования функции белка включают спасение миРНК-индуцированной фенотипов и в анализах пробирке активности. Для устранения любых потенциальных проблем, с добавлением большого LAP-тега, ранее мы генерироваться векторы ТАР-тегов, совместимые с этой системой, которые содержат мелкие метки, как FLAG, которые, менее вероятно, чтобы ингибировать функцию и локализацию белка, представляющего интерес ^4. Кроме того, LAP-маркировать векторы существуют для генерации C-концевой LAP-меченных белков или C-концевые TAP-меченных белков, которые совместимы с этой системой, которая может быть использована в тех случаях, когда LAP / TAP тег не переносится на N -terminus белка. Кроме того, гое соль и моющее средство концентрации буферов очистки (LAPX ^N) может быть изменен , чтобы увеличить или уменьшить Очистку строгость при соблюдении доли не имеет или слишком много взаимодействий. Аналогичным образом, процедура очистки сродством тандем является более жестким, чем одиночный процедуры очистки и слабые interactors могут быть потеряны, таким образом, одна схема очистки может быть использован, когда идентифицируются мало или совсем нет interactors.

Важно отметить , что существуют и другие подходы к GFP эпитоп мечения , которые позволяют крупномасштабного белка GFP тегах для локализации белка и очистки исследований ^24,25. К ним относятся подход BAC TransgenOmics , который использует бактериальные искусственные хромосомы , чтобы выразить GFP-меченый интерес генов из их родной среды , которая содержит все регуляторные элементы, имитирующем экспрессии ²⁴ эндогенный ген. Совсем недавно, cas9 / Одноэлементная наведением РНК (sgRNA) рибонуклеопротеидные комплексы (РНП), были использованы для завершенияogenously метить гены , представляющие интерес с системой сплит-GFP , который позволяет экспрессию GFP-меченый генов от их эндогенных локусов генома ^25. Хотя оба эти подхода позволяют экспрессию меченных белков при эндогенных условиях, по сравнению с протоколом LAP-мечения, описанного здесь, они не позволяют индуцибельной и перестраиваемой экспрессии меченых интерес генов. Кроме того, они еще должны применяться к тандемной эпитопа мечения для TAP. Важно также отметить, что другие системы мечения также могут быть модифицированы, чтобы стать совместимым с системой, описанной здесь для генерации индуцируемые эпитоп-меченый стабильных клеточных линий. Например, близость-зависимой идентификации биотин (BioID) привлекло значительное внимание в связи с его способностью определять пространственные и временные соотношения между взаимодействующих белков ^26. Этот метод использует белковые слитые в беспорядочном штамма кишечной палочки биотин лигазы Бира, который biotinylates любой белок в пределах ~ 10 нм радиусом фермента. Биотинилированные белки затем очищали с использованием аффинной захвата биотин-аффинной и анализировали на состав, с помощью масс-спектрометрии. Bira будет biotinylate любой белок в непосредственной близости, даже скоротечно, что делает его особенно хорошо подходит для обнаружения слабых взаимодействующих партнеров в сложном ^27. Кроме того, схема очистки не требует, что эндогенные белок-белковых взаимодействий остаются нетронутыми и могут быть выполнены в денатурирующих условиях, тем самым снижая уровень ложных срабатываний. В рамках нашего текущего протокола, замена вектора pGLAP1 на вектор Бира-мечения может превратить эту систему от идентификации белок-белковых взаимодействий на основе сродства к их обнаружения на основе близости. Такая система была бы весьма выгодным для обнаружения переходных взаимодействий белков как это происходит между многими взаимодействий фермент-субстрат и для картирования пространственно-временной белок-белок Interactions в рамках определенных структур , как было проведено для центросоме и ресничек ^26,28.

Materials

Flp-In T-REx Core Kit	Invitrogen	K6500-01	Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression
PETG, 5X	Nunc, Inc.	73520-734	Roller bottle for growing cells
PETG, 2.5X	Nunc, Inc.	73520-420	Roller bottle for growing cells
Cell stackers	Corning CellSTACK	3271	Cell stacker for growing cells
500 mL conical centrifuge tubes	Corning	431123	Tubes for harvesting cells
Anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122	Rabbit anti GFP antibody
Affiprep Protein A beads	Biorad	156-0006	Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies
Dimethylpimelimidate (DMP)	ThermoFisher Scientific	21667	Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads
TLA100.3 tubes	Beckman	349622	Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step
TEV protease	Invitrogen	12575-015	Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins
Precession Protease	GE Healthcare	27-0843-01	Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins
S-protein agarose	Novagen	69704	Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes
QIAquick DNA gel extraction kit	Qiagen	28704/28706	For use in purifying PCR products from an agarose gel
BP clonase II	Invitrogen	11789020	Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector
LR clonase II	Invitrogen	11791020	Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector
ccdB Survival 2 T1R E. coli	Invitrogen	A10460	Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors
Fugene 6	Promega	E2691	Transfection reagent for transfecting vectors into human cells
Tetracycline	Invitrogen	Q100-19	Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression
Doxycycline	Clontech	631311	Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression
Hygromycin B	Invitrogen	10687010	Drug for selecting stable LAP-tagged integrants
Kanamycin	Corning	61-176-RG	Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies
Ampicillin	Fisher	BP1760-5	Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels	Biorad	4561094	Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates
Silver Stain Plus Kit	Biorad	1610449	Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process
Coomassie Blue stain	Invitrogen	LC6060	Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible
Shuttle vector pDONR221	Invitrogen	12536017	Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest
Flippase expressing vector pOG44	Invitrogen	V600520	Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018	Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest
4X Laemmli sample buffer	Biorad	1610747	Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix
Luria broth (LB) media	Fisher	BP9723-2	Used for growing DH5α bacteria
DNA miniprep kit	Promega	A1222	Used for making DNA plasmid minipreps
DMEM/F12 media	Hyclone	SH30023.01	For growing Hek293 human cells
FBS lacking Tet	Altanta Biologicals	S10350	Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines
Trypsin	Hyclone	SH30042.01	For lifting Hek293 cell foci from plates
Protease inhibitor tablets	Roche	11836170001	Used for making protocol buffers, EDTA-free
10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol	Roche	11332473001	Used for making protocol buffers
PBS	Corning	21-040-CM	Used for making protocol buffers
Tween-20	Fisher	BP337-500	Used for making protocol buffers
Sodium Borate	Fisher	S249-500	Used for making protocol buffers
Boric Acid	Fisher	A78-500	Used for making protocol buffers
Ethanolamine	Calbiochem	34115	Used for making protocol buffers
NaCl	Fisher	P217-3	Used for making protocol buffers
KCl	Fisher	BP358-10	Used for making protocol buffers
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-25	Used for making protocol buffers
MgCl2	Fisher	M33-500	Used for making protocol buffers
Tris base	Fisher	BP152-5	Used for making protocol buffers