MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.
Klinisk embryo forglasning udviklet sig med udvikling af unikke vitrificeringsmidler enheder i det 21. århundrede og med den misforståelse, at ultra-hurtig afkøling i en "åben" systemet (dvs. direkte LN 2 kontakt) var en nødvendighed for at optimere vitrifikation succes. Dogmet omkring vigtigheden af nedkølingshastigheder førte til usikre fremgangsmåder underlagt teknisk variation og til skabelsen af vitrificeringsmidler enheder, bort vigtige kvalitetskontrol faktorer (f.eks, brugervenlighed, repeterbarhed, pålidelighed, sikkerhed mærkning og opbevaring sikkerhed). Forståelse af kvalitetskontrol fejl af andre enheder er tilladt for udviklingen af en sikker, gentagelig, og pålidelig uS-VTF metode til formål at minimere intra- og inter-tekniker variation. Lige så vigtigt, det kombinerede tilgængeligheden af to eksisterende FDA-kompatible enheder: 1) en 0,3-ml ionomer harpiks embryo strå med internaliseret, dual-farvet, pille-ptag mærkning med gentagelig svejsningsforsegling potentiale; og 2) forkortes, almindeligt anvendte, sterile 300-um ID flexipettes til direkte indlæse embryo (er) for at skabe et højt effektiv global vitrifikation enhed. Ligesom andre aseptisk, lukket sintringszonerne systemer (f.eks Høj sikkerhed Forglasning (HSV), Rapid-i, og VitriSafe) effektivt i reproduktiv medicin, microSecure Forglasning (uS-VTF) har bevist, at det kan opnå høj post-opvarmning overlevelse og graviditet resultater med sin opmærksomhed på enkelhed og reduceret teknisk variation. Selv om 0,3-ml embryo strå indeholder en intern hydrofob stik kommercielt blev erstattet med en standard sæd strå besidder bomuld polyvinylpyrrolidon (PVP) stik, det fastholdt sin ionomer harpiks sammensætning for at sikre svejse forsegling. Dog kan de bomuld stik væge ud væske-embryo indholdet af flexipettes ved kontakt. En modificeret uS-VTF metoden blev tilpasses til at omfatte en ekstra intern svejsningforsegle før stikket på enhedens lastning side. Den ekstra teknisk skridt til uS-VTF procedure har ikke påvirket dets succesfuld anvendelse, da høje overlevelsesrater (> 95%) og graviditet satser fortsat i dag.
Vitrifikation er den mest gennemslagskraftige assisteret reproduktiv teknologi i in vitro fertilisering (IVF) industrien siden udviklingen af ICSI. I dag er blastocyster er kryokonserveret uden tab i embryo levedygtighed tidligere var forbundet med konventionelle langsomt indefrysning metode 1. Med pålidelig post-opvarmning embryo overlevelse, er infertilitet industrien omdanne til det foretrukne brug af kryopræserverede embryo transfer cykler, der giver tilsvarende eller højere graviditetsudfald end traditionel frisk ægoplægning. I samarbejde med blastocyst biopsi og præimplantationsperioden genetisk screening (PGS), er forglasning blevet et vigtigt klinisk redskab til at optimere sunde levende fødsel resultater via euploid enkelt ægoplægning 2, 3.
Murint embryo forglasning blev udviklet i midten af 1980'erne 4, </sup> 5 og tilpasset dyr landbrug med 1990 6. Baseret på den forudsætning, at vitrificeringsopløsninger danner en metastabil glasseous tilstand, uden at beskadige iskrystaldannelse, har det vist sig mere effektivt bevare fuldstændig cellulær integritet af embryoner. Interessant, har lovende accept af forglasning i human embryologi ikke begynde at blive realiseret indtil det 21. århundrede. Tidlige publikationer fremme af anvendelsen af forglasning faldt sammen med udviklingen af unikke "åbne" systemenheder 7, 8, 9. Men vedtagelsen af forglasning til klinisk praksis var langsom, da det kom på et tidspunkt, hvor forbedringer i langsom blastocyst frysning også forekommer. Vellykket konventionel langsom hastighed frysning, udover forglasning, var tilpasset til hinanden med forbedringer i embryo dyrkningssystemer, samt med indeholdendion af blastocoelen-kollapse tilgange, som forbedret både den samlede overlevelse trophectoderm og efterfølgende implantation 10.
I det sidste årti har forglasning teknologi hurtigt fortrængt konventionelle frysning praksis. I vid udstrækning, dette skyldtes udvikling af specialiserede vitrificeringsmidler enheder. Nogle af disse enheder har hæmmet den overordnede sikkerhed, effektivitet og klinisk forglasning ved at indføre iboende konstruktionsfejl til enheder, der anvendes i IVF industri 11. Faktisk nuancerne i forskellige enheder indfører betydelig teknisk variation mellem programmer, der almindeligvis omtales som "tekniske underskrifter" 12. Således videnskabelige tidsskrifter, ligesom Tidende visualiseres Forsøg (JOVE), kan tjene som en værdifuld ressource for at demonstrere tekniske detaljer, der vil bidrage til at reducere resultatet variation. Et andet vedvarende problem er at sogle embryologer fortsat misinformeret, selv i dag, er baseret på påstande om, at de "ultra-hurtig afkøling af embryoner eller oocytter i en 'åben vitrifikation system" (dvs. direkte embryo kontakt med flydende nitrogen (LN 2)) er en forudsætning for at optimere succesrater. " Det er klart, denne tro er unøjagtige, baseres på afprøvede succes aseptisk lukkede systemer 13, 14, 15.
Baseret på de cryobiological principper forglasning, effekten af forglasning er mere stærkt afhængig af opvarmning satser end ved afkøling satser 16, 17, 18. I almindelighed uafhængigt af forglasning anordning, der anvendes, skal den opvarmningshastighed overstige afkølingshastigheden at forsikre høje overlevelsesrater. Høje opvarmning satser minimere risikoen for eventuel is vækst (dvs. Recrystallization af kerneholdige urenheder i cryo-løsninger) under afglasning fase af opvarmning. Indrømmet, kan stabiliteten af vitrificeringsopløsningen (dvs. typen og koncentrationen af kryobeskyttelsesmidler anvendt) have en forstyrrende effekt, men dette behandles i en særskilt publikation 11. I betragtning af de kølende-opvarmning forrentede spørgsmål blev MicroSecure vitrifikation (uS-VTF) udviklet i 2008 som en billig, ikke-kommerciel, FDA-kompatible metode, optimeret kvalitetskontrol aspekter af vitrifikation. Det var enestående, fordi det tilbudt forfalskes, internaliseres, dual-farvet mærkning. Endvidere ved lastning og lagring af embryoner direkte i sterile flexipette anvendes til pipettering (dvs. uden pipettering til en sekundær enhed overflade) og ved anvendelse af ionomer-harpiks sugerør, der fuldstændig svejsningsforsegling anvendelse af en automatiseret sealer, teknisk variation reelt er fjernet.
Ved vurderingen af completeness af vitrificeringsmidler udstyr til potentielle anvendelse, er der flere kvalitetskontrol faktorer, der bør tages i betragtning, herunder: 1) mærkning potentielle -Kan etiketter være sikkert levet? Er de Tamperproof? Har de tilbyder tofarvet potentiale identifikation? Kræver det en sekundær etiket, og kan etiketten let fjernes for registreringsformål (dvs. patientens kontrol) efter opvarmning? 2) Teknisk lethed -Kan embryoner let indlæst i / på enheden i tide og simpelthen identificeres og spores efter opvarmning? 3) Procedural enkelhed / Repeterbarhed -Er det vitrifikation metode tilbyde enkelhed og pålidelighed, der nemt giver mulighed for repeterbarhed, hvilket minimerer variationen mellem teknikere (interne) og programmer (eksterne)? 4) LN 2 lagringskapacitet -Kan enhederne nemt og sikkert håndteres og identificeret? Er deres storase potentiel plads effektiv? Kan enheden tilbyde sikkerhed mod fysisk skade eller mulige forureninger som et aseptisk lukket system? 5) Inddrivelse potentiale / Overlevelsesevne -Er enhedens design udsat for potentielle problemer i den garanterede inddrivelse af embryoner, og de vil sikkert sintre og opretholde fuldstændig cellulær integritet post-opvarmning? Sidstnævnte specifikke kvalitet bekymring, recovery rate, rent faktisk er blevet overraskende minimeret i offentliggjorte rapporter; dette gøres ved generelt at skjule det ugunstige resultat (dvs. tabte embryo eller æg) i typisk-god overlevelsesrater. Alle enheder udsat for inkonsekvent opsving (<99%) er behæftet med alvorlige fejl og udgør en proceduremæssig forpligtelse.
Vores aseptisk, lukkede uS-VTF metode er strategisk udviklet til at redegøre for hver kvalitet-kontrolforanstaltning. Men efter 5 års overlegen klinisk succes og validering 14, proceduren havde to være ændret. De oprindelige 0,3-ml embryo strå (som har et hydrofobt prop) blev fjernet fra IVF industrien og erstattes med en 0,3-ml sæd strå besidder en standard bomuld / PVP stik (dvs. relabeled som sæd / embryo halm). Denne proceduremæssige papir beskriver de specifikke skridt og strategier, der er nødvendige for at gennemføre uS-VTF sikkert, simpelthen, og effektivt. Desuden fremhæver vi modifikationen (s) til pålidelig redegøre for begrænsninger forsyning, indtil alternativ ideal halm container genindføres tilbage i det kliniske laboratorium.
Dag, er der en høj forventning om at opnå fuldstændig blastocyst overlevelse (> 95%) og opnå implantation succes ligner den i friske embryoner. Nogle grupper har foreslået, at de levende fødselstal af forglasset embryo transfer cyklusser er måske endnu højere end friske blastocyster når den intakte kryopræserverede embryo er transplanteret ind i en sund, ikke-hormonelt-stimuleret livmoder. Vores data indikerer klart, at forglasning effektivt og pålideligt fastholder levedygtighed friske embryo. Desuden har vi bevist, at vores aseptisk, lukket metode, kaldet MicroSecure Forglasning (uS-VTF), kan opnå et optimalt resultat kan sammenlignes med eller større end de kommercielle standarder (dvs. åbne enhed systemer), der anvendes i IVF industrien.
Variation er forbundet med teknisk repeterbarhed og pålidelighed mellem personer, der bruger et væld af vitrificeringsmidler enheder / metoder. Til gengæld har dette resulteret i inconsistencies mellem programmer anvender vitrifikation. Derfor er det ikke overraskende, at enheden fortrolighed er en vigtig faktor med hensyn til laboratoriets præstationer og vellykkede resultater. Det er dette koncept af "teknisk signatur" 11, der forklarer, hvorfor repeterbarhed mellem programmer kan være problematisk. Ikke alene har udviklingen af mere end et dusin kommercielle enheder kompliceret dette fænomen, har det skabt kvalitetskontrol bekymringer. Heldigvis lukket sintringszonerne systemer, ligesom uS-VTF, Rapid-I, og VitriSafe, nu viser sig at være lige så effektiv til at åbne enhedens systemer 12, 13, 14.
MicroSecure VTF er en roman, aseptisk forglasning teknik udviklet med teknisk lethed, pålidelighed og cryo-sikkerhed i tankerne. Ved at kombinere brugen af to tidligere godkendt, FDA-kompatible enheder, det er en ikke-kommerciel vitrifikation systemet wed den klare fordel af at have en etableret lav pris i modsætning til specialiserede enheder. Desuden har sin unikke Manipuleringssikker og internaliseret dual-farvet mærkningsordning, samt talrige andre kvalitetskontrol fordele, lavet uS-VTF en attraktiv global løsning 11. Som en ikke-kommerciel VTF enhed, dog er dens udbredte industri ansøgning udvikler sig langsomt. Kun gennem den fortsatte offentliggørelse af dets sikkerhed, og klinisk effektivitet vil uS-VTF gevinst voksende udnyttelse.
I august 2014 når de står med den manglende evne til at erhverve den oprindelige 0,3 ml embryo strå fremstillet med en indre, ikke-fugtspredende hydrofobe stik, var vi i stand til pålideligt ændre uS-VTF metoden. Kort sagt, blev de nye 0,3-ml sæd / embryo strå med deres bomuld-PVP stik effektivt tilpasset. Dette blev simpelthen opnået ved at skabe en indvendig forsegling før bomuldsprop, hvilket forhindrer kontakt og fluidvægende medåben VTF spids (dvs. flexipette indeholdende embryo eller æg). Desuden, hvis 40-mm ID-stænger er ikke tilgængelige, opdrift problem forbundet med de lysere 30 mm stænger kan kontravægt ved hjælp af to kuglelejer.
Disse yderligere trin har gjort teknikken lidt mindre enkel, men stadig meget effektiv. I dag, økonomi og effektivitet bliver stadig bekymringer, som biopsi blastocyster typisk forglasset individuelt indtil deres euploidy status er bekræftet på en genetik rapport. Blastocyster med et bekræftet ikke-levedygtige aneuploidi status typisk bliver kasseret, med patient samtykke, inden ugen. Således er et flertal (> 50%) af VTF udstyr kasseres efter kortvarig opbevaring, der forårsager en eskalerende årlige omkostninger ved brug af kommercielle enheder. Samlet, uS-VTF er en yderst effektiv, pålidelig og gentagelig procedure for kryopræservering af humane blastocyster. Den overlegne kvalitet-kontrol design securely etiketter og sikkert gemmer embryoner / oocyter samtidig fjerne recovery fiasko og optimering af post-opvarmning overlevelse og levedygtighed, hvilket begrunder systemets anvendelse som en universel tilgang til embryo vitrifikation.
The authors have nothing to disclose.
MC Schiewe takker Mr. Forest Garner på fertilitet Center Las Vegas for hans statistiske ekspertise i at analysere og evaluere de årlige CDC og SART data. Også forfatterne takker deres Medical Director, Dr. Robert E. Anderson, for hans dedikeret support og tro på vores tekniske evner og ekspertise.
Aluminum Cane | IVM | XC055 | ||||
Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel | |||
CBS semen/embryo straw, 0.3ml | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile | |||
Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted | |||
Culture tubes, 15ml | Falcon | 352099 | Conical | |||
Culture tubes, 10ml | Falcon | 352057 | Snap-cap | |||
Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | ||||
Filter, 250ml | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm | |||
Flasks, Tissue Culture 50ml | Falcon | 353014 | ||||
Flexipettes, 300μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack | |||
Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | ||||
Forcep,Splinter – fine | Miltex | 17-305 | ||||
Goblet | IVM | PA003 | ||||
Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110V or 220V with adapter | |||
Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100ml | with non-essential AA's | ||||
Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors | |||
Liquid Nitrogen Tank, 40L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage | |||
LN2 Dewar flask, 0.5L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel | |||
6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case | |||
Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex | |||
Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351006 | ||||
Petri Dishes, 58mm | Nunc | 150288 | ||||
Petri Dishes, 100mm | Falcon | 351029 | ||||
Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10-100μl | |||
Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable | |||
Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | ||||
Pipettes, Serological 1ml | Falcon | 357521 | ||||
Pipettes, Serological 2ml | Falcon | 357507 | ||||
Pipettes, Serological 5ml | Falcon | 357543 | ||||
Pipettes, Serological 10ml | Falcon | 357551 | ||||
Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | ||||
Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | ||||
Sterile Gauze pads, 4"x4" | Kendall Healthcare | 6939 | ||||
Synthetic serum | Life Global or | LGPS-20 ; 20ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10ml | purchase low endotoxin lot | ||||
Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50ml flasks, 1year | |||
17.1g/flask +Medium to 50ml | ||||||
makes a 1M solution | ||||||
Filter with 0.22µm unit | ||||||
Timer | Nalgene | 5016-001 | ||||
Thawing Solution | Innovative | BL-TS | T1, T2, T3, T4 | |||
Cryo Enterprises | (≤1.0M Sucrose) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
Vitrification Solution*,** | Innovative | BL-VS | V1, V2, V3 | |||
Cryo Enterprises | (≥7.9M [Glycerol/EG]) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | ||||||
** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. |