MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.
Klinische embryo verglazing geëvolueerd met de ontwikkeling van unieke verglazing apparaten in de 21 ste eeuw en met de misvatting dat ultra-snelle koeling in een 'open' systeem (dat wil zeggen, direct LN 2 contact) was een noodzaak om vitrificatie succes te optimaliseren. Het dogma rond het belang van het koelen van de tarieven leidde tot onveilige praktijken onderworpen aan technische variatie en tot de oprichting van verglazing apparaten die belangrijke kwaliteitscontrole factoren (bijvoorbeeld, gebruiksgemak, herhaalbaarheid, betrouwbaarheid, veiligheid etikettering en opslag veiligheid) buiten beschouwing gelaten. Inzicht in de kwaliteitscontrole gebreken van andere apparatuur toegestaan voor de ontwikkeling van een veilig, veilige, herhaalbare en betrouwbare mS-VTF methode gericht op intra- en inter-technicus variatie te minimaliseren. Net zo belangrijk is, combineerde de beschikbaarheid van twee bestaande FDA-compatibele apparaten: 1) een 0,3-mL ionomere hars embryo stro met geïnternaliseerde, dual-gekleurd, tamper-pdak labeling met herhaalbare las zegel potentieel; en 2) verkort, veelgebruikte, 300-um ID steriele flexipettes direct het embryo (en) te laden om een zeer effectieve globale verglazing apparaat. Net als andere aseptische, gesloten verglazing systemen (bijvoorbeeld High Security Vitrificatie (HSV), Rapid-i, en VitriSafe) effectief gebruikt in de reproductieve geneeskunde, microSecure Vitrificatie (mS-VTF) heeft bewezen dat het een hoge post-warming overleven en zwangerschap kunnen bereiken uitkomsten met zijn aandacht voor eenvoud, en minder technische variant. Hoewel de 0,3 ml embryo stro met een intern hydrofoob plug commercieel werd vervangen door een standaard sperma rietje bezit katoen polyvinylpyrrolidon (PVP) stekkers, handhaafde de ionomere hars samenstelling te lassen sluiting te waarborgen. Echter, de katoen stekkers lont uit de vloeistof-embryo inhoud van de flexipettes bij contact. Een gemodificeerd pS-VTF methode werd aangepast om een extra interne las omvattendichten alvorens de stekker van het apparaat laden kant. De toegevoegde technische stap naar de microsiemens-VTF procedure heeft geen invloed op haar succesvolle toepassing, zo hoog overlevingskansen (> 95%) en zwangerschap tarieven blijven vandaag.
Vitrificatie is de meest invloedrijke geassisteerde reproductieve technologie in de in vitro fertilisatie (IVF) industrie sinds de ontwikkeling van intracytoplasmatische sperma-injectie. Vandaag de dag, blastocysten zijn gecryopreserveerd zonder verlies in levensvatbaarheid van het embryo eerder in verband met conventionele langzaam invriezen methoden 1. Met betrouwbare post-warming embryo te overleven, is de onvruchtbaarheid industrie transformeren in de gewenste gebruik van gecryopreserveerde embryo transfer cycli, die vergelijkbaar of hoger zwangerschapsuitkomsten dan de traditionele verse embryo transfer opleveren. In samenwerking met blastocyst biopsie en pre-implantatie genetische screening (PGS), is verglazing uitgegroeid tot een belangrijk klinisch hulpmiddel om gezonde live-geboorte resultaten te optimaliseren via euploid single embryo transfer 2, 3.
Muizen-embryo verglazing werd ontwikkeld in het midden van de jaren 1980 4, </sup> 5 en aangepast aan de veeteelt in 1990 6. Gebaseerd op de vooronderstelling dat oplossingen voor vitrificatie vormen een metastabiele toestand glasseous, zonder beschadiging ijs- kristalvorming, heeft bewezen de totale cellulaire integriteit van embryo efficiënter behouden. Interessant, heeft de veelbelovende acceptatie van vitrificatie in de menselijke embryologie niet beginnen te realiseren tot de 21 ste eeuw. Vroege publicaties bevorderen van verglazing samenviel met de ontwikkeling van unieke "open" systeemapparaten 7, 8, 9. Echter, de goedkeuring van vitrificatie in de klinische praktijk was traag, zoals het kwam op een moment dat verbeteringen in slow blastocyst invriezen werden ook optreedt. Succesvolle conventionele langzame snelheid invriezen, naast verglazing, in lijn gebracht met verbeteringen in kweeksystemen embryo, en met de incorporation van blastocoel-instortende benaderingen, die zowel de totale overleving van trophectoderm verbeterd en vervolgens 10 implantatie.
In het laatste decennium, heeft verglazing technologie snel verdrongen conventionele bevriezing praktijken. Grotendeels, dit te wijten aan de ontwikkeling van gespecialiseerde inrichtingen verglazing. Sommige van deze apparaten zijn de algemene veiligheid, efficiëntie en effectiviteit van de klinische verglazing gehandicapt door het introduceren inherent ontwerpfouten naar apparaten die worden gebruikt in de IVF-industrie 11. Inderdaad, de nuances van verschillende voorzieningen teneinde aanzienlijke technische verschillen tussen programma's, meestal aangeduid als "technische handtekeningen" 12. Zo, wetenschappelijke tijdschriften, zoals het Journal of Gevisualiseerde Experiments (JoVE), kan dienen als een waardevolle bron voor het aantonen van de technische details, die zal bijdragen tot het resultaat variatie te verminderen. Een ander permanent probleem is dat some embryologen blijven worden geïnformeerd, zelfs vandaag de dag, op basis van beweringen dat de "ultra-snelle afkoeling van embryo's of eicellen in een 'open verglazing system' (dat wil zeggen, direct embryo contact met vloeibare stikstof (LN 2)) is een voorwaarde voor het optimaliseren slagingspercentages. " Duidelijk dat deze overtuiging onjuist is, gebaseerd op het bewezen succes van aseptische gesloten systemen 13, 14, 15.
Gebaseerd op de principes van cryobiological verglazing, de effectiviteit van vitrificatie is sterk afhankelijk opwarmsnelheden dan bij een koelsnelheid van 16, 17, 18. In het algemeen, onafhankelijk van de verglazing apparaat gebruikt, de snelheid van opwarmen moet de afkoelsnelheid overschrijden hoge overleving te verzekeren. Hoge opwarming zoveel mogelijk te beperken de mogelijkheid voor elke ijs groei (dwz de Recrystallization van kernen onzuiverheden in cryo-oplossingen) tijdens de ontglazing fase van de opwarming van de aarde. Toegegeven, kan de stabiliteit van de oplossing voor vitrificatie (dat wil zeggen de soort en concentratie van cryoprotectieve middelen toegepast) een verstorend effect, maar dit is in een afzonderlijk 11 publicatie. Gezien de cooling-warming rate issues, MicroSecure Vitrificatie (mS-VTF) is ontwikkeld in 2008 als een goedkope, niet-commerciële, FDA-compliant methode die het kwaliteitssysteem aspecten van vitrificatie geoptimaliseerd. Het was uniek in dat het aangeboden tamper-proof, geïnternaliseerd, dual-gekleurde labeling. Verder kan door het laden en opslaan van de embryo's direct in het steriele flexipette voor pipetteren (dus zonder pipetteren een secundaire inrichtingoppervlak) en met ionomere hars rietjes die volledig las afdichting een geautomatiseerd sealer, technische variatie is effectief geëlimineerd.
Bij de beoordeling van de completeness van verglazing apparaten voor potentieel gebruik, zijn er verschillende kwaliteitscontrole factoren waarmee rekening moet worden gehouden, waaronder: 1) Het labelen van potentiële -Kan labels goed worden nageleefd? Zijn ze Tamperproof? Bieden ze dual-color identificatie potentieel? Is het een secundaire etiket vereist, en kan het etiket eenvoudig worden verwijderd voor administratieve doeleinden (dat wil zeggen, de patiënt verificatie) post-warming? 2) Technische gemak -Kan embryo's gemakkelijk worden geladen in / op het apparaat in een tijdig en eenvoudig geïdentificeerd en opgespoord post-warming? 3) Procedurele eenvoud / herhaalbaarheid -Heeft de verglazing methode aanbod eenvoud en betrouwbaarheid die gemakkelijk maakt voor de herhaalbaarheid, die de variatie tussen de technici (intern) en programma's (extern) minimaliseert? 4) LN 2 opslagcapaciteit eenvoudig en veilig -Kan de apparaten worden behandeld en geïdentificeerd? Is hun stowoeden potentiële ruimte efficiënt? Heeft het apparaat bieden veiligheid en zekerheid van fysieke schade of eventuele verontreinigingen als een aseptische gesloten systeem? 5) Herstel potentieel / Overlevingsvermogen -Is het apparaat ontwerp gevoelig zijn voor mogelijke problemen in de gegarandeerde herstel van de embryo's, en zullen ze betrouwbaar verglazen en onderhouden volledige cellulaire integriteit post-warming? De laatste specifieke kwaliteit van zorg, de recovery rate, daadwerkelijk is verrassend geminimaliseerd gepubliceerde rapporten; Dit wordt gedaan door het algemeen het verbergen van de ongunstige uitkomst (dwz verloren embryo of ei) in typisch goede overlevingskansen. Elk apparaat vatbaar voor inconsistent herstel (<99%) is ernstig gebrekkig en vormt een procedurele verplichting.
Onze aseptische, gesloten mS-VTF methode is strategisch ontwikkeld om rekening te houden voor elke kwaliteitscontrole maatregel. Echter, na 5 jaar van het klinisch succes en validatie 14 De procedure had to worden gewijzigd. De originele 0,3-mL embryo rietjes (het bezit van een hydrofobe plug) werden uit de IVF-industrie verwijderd en vervangen door een 0.3-mL sperma stro het bezit van een standaard katoen / PVP plug (dwz opnieuw gelabeld als een sperma / embryo stro). Deze procedurele document schetst de specifieke stappen en strategieën die nodig zijn om veilig, eenvoudig en effectief te implementeren mS-VTF. Verder hebben we aandacht voor de modificatie (s) die nodig is om op betrouwbare wijze rekening te houden met het aanbod beperkingen, totdat een alternatief ideale stro container terug in het klinisch laboratorium opnieuw ingevoerd.
Tegenwoordig is er een hoge verwachtingen van het bereiken van volledige blastocyst overleving (> 95%) en het bereiken implantatie succes vergelijkbaar met die van verse embryo. Sommige groepen hebben gesuggereerd dat de live geboortecijfers van verglaasd embryo transfer cycli zijn misschien zelfs hoger dan verse blastocysten wanneer de intacte gecryopreserveerd embryo is getransplanteerd in een gezonde, niet-hormonaal gestimuleerde baarmoeder. Onze gegevens geven duidelijk aan dat vitrificatie effectief en betrouwbaar de levensvatbaarheid van de verse embryo. Verder hebben we aangetoond dat onze aseptische, gesloten methode, genaamd MicroSecure verglazing (uS-VTF), een optimaal resultaat vergelijkbaar met of groter dan de commerciële standaarden (dwz geopend apparaatsystemen) van de IVF industrie kan bereiken.
Variant wordt geassocieerd met technische herhaalbaarheid en betrouwbaarheid tussen individuen met een veelvoud van de verglazing apparaten / methoden. Op zijn beurt heeft dit geleid tot inconsistencies tussen programma's toe te passen verglazing. Daarom is het niet verwonderlijk dat apparaat vertrouwdheid een belangrijke factor is met betrekking tot laboratorium vaardigheid en succesvolle resultaten. Het is dit concept van "technische signature" 11, dat verklaart waarom herhaalbaarheid tussen programma's problematisch kan zijn. heeft niet alleen de ontwikkeling van meer dan een dozijn commerciële apparaten ingewikkeld dit verschijnsel, heeft het creëerde kwaliteitscontrole zorgen. Gelukkig verglazing gesloten systemen, zoals uS-VTF, Rapid-I en VitriSafe, nu blijken even effectief systemen inrichting 12, 13, 14 open zetten.
MicroSecure VTF is een roman, aseptische verglazing techniek ontwikkeld met technische gemak, betrouwbaarheid en cryo-veiligheid in het achterhoofd. Door het combineren van het gebruik van twee eerder goedgekeurde, FDA-compatibele apparaten, het is een niet-commercieel verglazing systeem wet de duidelijke voordeel van een gevestigde goedkope, in tegenstelling tot gespecialiseerde machines. Daarnaast zijn unieke tamperproof en geïnternaliseerd dual-gekleurde labeling-systeem, evenals tal van andere kwaliteitscontrole voordelen hebben gemaakt mS-VTF een aantrekkelijke wereldwijde optie 11. Als een niet-commerciële VTF apparaat, echter, het wijdverbreide industrie applicatie wordt langzaam evolueert. Alleen door de voortdurende publicatie van de veiligheid, beveiliging en klinische effectiviteit zal mS-VTF gain groeiende gebruik.
In augustus 2014 wanneer geconfronteerd met het onvermogen om de oorspronkelijke 0,3 ml embryo stro vervaardigd met een inwendige, niet-absorberende hydrofobe plug verkrijgen, konden we de pS-VTF methode betrouwbaar wijzigen. In het kort werden de nieuwe 0.3-mL sperma / embryo rietjes met hun katoenen-PVP pluggen effectief aangepast. Dit was gewoon bereikt door het creëren van een binnenste afdichting voor de katoen stekker, waardoor het voorkomen van contact en vocht wicking met deopen einde VTF tip (dat wil zeggen, de flexipette met het embryo of de eieren). Bovendien, als 40-mm ID staven zijn niet toegankelijk, het drijfvermogen probleem in verband met de lichtere 30-mm staven kunnen worden contragewichten met twee kogellagers.
Deze extra maatregelen hebben de techniek iets minder eenvoudige zeer effectief gemaakt, maar toch. Vandaag de dag, de economie en de werkzaamheid worden steeds belangrijker problemen, zoals biopsie blastocysten meestal individueel worden verglaasd totdat hun euploidy status wordt bevestigd op een genetica rapport. Blastocysten met een bevestigde niet-levensvatbare aneuploidy staat meestal krijgen weggegooid, met toestemming van de patiënt, binnen enkele weken. Zo kan een meerderheid (> 50%) van de VTF apparaten worden weggegooid na korte termijn opslag, het veroorzaken van een escalerende jaarlijkse kosten bij het gebruik van commerciële apparaten. Overall, uS-VTF is een zeer effectieve, betrouwbare en reproduceerbare werkwijze voor cryopreservatie van menselijke blastocysten. De superieure kwaliteit-control design securely labels en veilig opgeslagen embryo's / eicellen terwijl het elimineren van herstel mislukking en het optimaliseren van de post-warming overleven en de levensvatbaarheid, die het gebruik van het systeem als een universele benadering van embryo verglazing rechtvaardigt.
The authors have nothing to disclose.
MC Schiewe wil de heer Bos Garner danken aan het Fertility Center van Las Vegas voor zijn statistische expertise in het analyseren en evalueren van de jaarlijkse CDC en SART data. Ook de auteurs willen hun medisch directeur, Dr. Robert E. Anderson, bedanken voor zijn toegewijde steun en vertrouwen in onze technische vaardigheden en expertise.
Aluminum Cane | IVM | XC055 | ||||
Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel | |||
CBS semen/embryo straw, 0.3ml | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile | |||
Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted | |||
Culture tubes, 15ml | Falcon | 352099 | Conical | |||
Culture tubes, 10ml | Falcon | 352057 | Snap-cap | |||
Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | ||||
Filter, 250ml | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm | |||
Flasks, Tissue Culture 50ml | Falcon | 353014 | ||||
Flexipettes, 300μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack | |||
Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | ||||
Forcep,Splinter – fine | Miltex | 17-305 | ||||
Goblet | IVM | PA003 | ||||
Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110V or 220V with adapter | |||
Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100ml | with non-essential AA's | ||||
Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors | |||
Liquid Nitrogen Tank, 40L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage | |||
LN2 Dewar flask, 0.5L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel | |||
6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case | |||
Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex | |||
Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351006 | ||||
Petri Dishes, 58mm | Nunc | 150288 | ||||
Petri Dishes, 100mm | Falcon | 351029 | ||||
Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10-100μl | |||
Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable | |||
Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | ||||
Pipettes, Serological 1ml | Falcon | 357521 | ||||
Pipettes, Serological 2ml | Falcon | 357507 | ||||
Pipettes, Serological 5ml | Falcon | 357543 | ||||
Pipettes, Serological 10ml | Falcon | 357551 | ||||
Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | ||||
Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | ||||
Sterile Gauze pads, 4"x4" | Kendall Healthcare | 6939 | ||||
Synthetic serum | Life Global or | LGPS-20 ; 20ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10ml | purchase low endotoxin lot | ||||
Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50ml flasks, 1year | |||
17.1g/flask +Medium to 50ml | ||||||
makes a 1M solution | ||||||
Filter with 0.22µm unit | ||||||
Timer | Nalgene | 5016-001 | ||||
Thawing Solution | Innovative | BL-TS | T1, T2, T3, T4 | |||
Cryo Enterprises | (≤1.0M Sucrose) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
Vitrification Solution*,** | Innovative | BL-VS | V1, V2, V3 | |||
Cryo Enterprises | (≥7.9M [Glycerol/EG]) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | ||||||
** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. |