MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.
Klinisk embryo forglassing utviklet seg med utvikling av unike forglassing enheter i det 21. århundre, og med den misforståelse at ultra-rask avkjøling i et "åpent" system (dvs. direkte LN 2 kontakt) var en nødvendighet for å optimalisere vitrification suksess. Dogmet rundt viktigheten av kjølepriser førte til risikable handlinger underlagt teknisk variasjon og til etableringen av forglassing enheter som oversett viktige kvalitetskontroll faktorer (for eksempel brukervennlighet, repeterbarhet, pålitelighet, merking sikkerhet og lagring sikkerhet). Forstå kvalitetskontroll feil av andre enheter som er tillatt for utviklingen av en trygg, sikker, repeterbare og pålitelig iS-VTF metode forsøkte å minimere intra- og inter-tekniker variasjon. Like viktig er det kombinert tilgjengeligheten av to eksisterende FDA-kompatible enheter: 1) en 0,3-ml ionomer harpiks embryo halm med internalisert, dual-farget, tamper-pTaket merking med repeat sveis segl potensial; og 2) forkortet, vanlig brukte, sterile 300 mikrometer ID flexipettes å direkte laste embryo (er) for å skape en svært effektiv global vitrification enhet. Som andre aseptisk, lukket forglassing systemer (f.eks, High Security Forglassing (HSV), Rapid-i, og VitriSafe) effektivt brukes i reproduktiv medisin, microSecure Forglassing (uS-VTF) har vist at det kan oppnå høy post-oppvarming overlevelse og graviditet utfall med sin oppmerksomhet til enkelhet, og redusert teknisk variasjon. Selv om 0,3-mL embryo halminneholdende en hydrofob indre pluggen var kommersielt erstattet med en standard sæd strå besitter bomull-polyvinylpyrrolidon (PVP) plugger, den opprettholdt sin ionomere harpiksblandingen for å sikre tetning sveis. Imidlertid kan de bomullsplugger veken ut fluid-embryo innholdet i flexipettes ved kontakt. En modifisert uS-VTF metoden ble tilpasset for å omfatte en ekstra innvendig sveisforsegle før pluggen på enheten lasting side. Den ekstra teknisk skritt til uS-VTF prosedyren har ikke påvirket den vellykkede anvendelse, så høy overlevelse (> 95%) og graviditet priser fortsetter i dag.
Vitrifisering er den mest virkningsfulle assistert befruktning i in vitro fertilisering (IVF) bransjen siden utviklingen av intracytoplasmatisk spermieinjeksjon. I dag, blastocyster er oppbevart uten tap i embryo levedyktighet tidligere forbundet med konvensjonelle langsom frysing metoder 1. Med pålitelig post-oppvarming embryo overlevelse, er infertilitet bransjen transformerer til den foretrukne bruk av cryopreserved embryo transfer sykluser, som gir tilsvarende eller høyere svangerskapsutfall enn tradisjonelle ferske embryo. I samarbeid med blastocyst biopsi og preimplantation genetisk screening (PGS) har Vitrifisering blitt et viktig klinisk verktøy for å optimalisere sunn levende fødsels utfall via euploid enkelt embryo to, tre.
Murine embryo forglassing ble utviklet på midten av 1980-tallet 4, </sup> 5 og tilpasset husdyrhold av 1990 seks. Basert på forutsetningen at forglassing løsninger danner en metastabil glasseous tilstand, uten å skade is krystalldannelse, har det vist seg å mer effektivt bevare komplett mobil integritet embryoer. Interessant, gjorde lovende aksept av Vitrifisering i human embryologi ikke begynne å bli realisert før det 21. århundre. Tidlig publikasjoner som fremmer bruken av forglassing falt sammen med utvikling av unike "åpne" system enheter 7, 8, 9. Men innføringen av forglassing i klinisk praksis var treg, så det kom på et tidspunkt da forbedringer i sakte blastocyst frysing ble også forekommer. Vellykket konvensjonell langsom hastighet frysing, i tillegg til forglassing, ble justert med forbedringer i embryo kultursystemer, så vel som med innarbeidelseion av blastocoele-kollapse tilnærminger, som forbedret både total overlevelse av trophectoderm og senere implantasjon 10.
I det siste tiåret har Vitrifisering teknologi raskt fortrengt konvensjonell frysing praksis. I stor grad, dette var på grunn av utviklingen av spesialiserte forglassing enheter. Noen av disse enhetene har handikappet den generelle sikkerheten, effektiviteten og effektiviteten av klinisk Vitrifisering ved å innføre iboende designfeil til enheter som brukes i IVF industrien 11. Faktisk nyansene av ulike enheter innføre betydelig teknisk variasjon mellom programmer, ofte referert til som "tekniske signaturer" 12. Dermed vitenskapelige tidsskrifter, som Journal of visualisert Experiments (Jove), kan tjene som en verdifull ressurs for å demonstrere tekniske detaljer, som vil bidra til å redusere resultatet variasjon. Et annet pågående problem er at some embryologists fortsette å bli feilinformert, selv i dag, basert på påstander om at "ultra-rask nedkjøling av embryoer eller ubefruktede egg i en" åpen Vitrifisering system "(dvs. direkte embryo kontakt med flytende nitrogen (LN 2)) er en forutsetning for å optimalisere suksessrate. " Åpenbart er denne troen unøyaktig, basert på den velprøvde suksessen aseptisk lukkede systemer 13, 14, 15.
Basert på cryobiological prinsippene for forglassing, virkningen av forglassing er mer sterkt avhengig av oppvarmingsfrekvens enn ved avkjøling priser 16, 17, 18. Generelt er uavhengig av forglassing anordningen brukes, må oppvarmingshastigheten overstiger den avkjølingshastighet for å sikre høy overlevelse. Høye oppvarming priser minimere muligheten for eventuell is vekst (dvs. Recrystallization av kjerneurenheter i kryo-løsninger) under avglassing fasen av oppvarmingen. Riktignok kan stabiliteten av forglassing løsningen (dvs. den typen og konsentrasjonen av cryobeskyttelsesmidler anvendes) har en forvirrende virkning, men dette er omtalt i en egen publikasjon 11. Med tanke på kjøling-oppvarming rente problemer, ble MicroSecure Vitrifisering (uS-VTF) utviklet i 2008 som en billig, ikke-kommersiell, FDA-godkjent metode som optimalisert kvalitetskontroll aspekter av vitrification. Det var unik ved at det tilbys tamper-proof, internalisert, dual-farget merking. Videre, ved lasting og lagring av embryoer direkte i sterile flexipette brukes til pipettering (dvs. uten pipettering til en sekundær enhet overflate) og ved å bruke ionomer-harpiks sugerør som fullstendig sveis segl hjelp av en automatisert fangstskuta, teknisk variasjon har vært effektivt eliminert.
Ved vurdering av completeness av forglassing enheter for potensiell bruk, er det flere kvalitetskontroll faktorer som bør tas i betraktning, herunder: 1) merking potensielle -Kan etiketter være forsvarlig fulgt? Er de fikle? Har de tilbyr dual-color identifikasjon potensial? Krever det en sekundær etikett, og kan etiketten enkelt fjernes for journalføring formål (dvs. pasienten verifisering) etter oppvarming? 2) Teknisk lette -Kan embryoer lett bli lastet inn / på enheten på en riktig måte, og bare identifisert og sporet etter oppvarming? 3) Prosedyre enkelhet / Repeterbarhet -Har forglassingsprosessen metoden tilbudet enkelhet og pålitelighet som enkelt lar for repeterbarhet, noe som minimerer variasjonen mellom teknikere (intern) og programmer (ekstern)? 4) LN 2 lagringskapasitet -Kan enhetene er enkelt og trygt håndtert og identifisert? Er de storaseri potensiell plass effektiv? Har enheten tilbudet sikkerhet og trygghet mot fysiske skader eller mulige forurensninger som en aseptisk lukket system? 5) Recovery potensialet / overlevelsesevne -Er enheten utformingen utsatt for potensielle problemer i den garanterte utvinning av embryoer, og de vil sikkert vitrifisere og opprettholde full cellulær integritet post-oppvarming? Sistnevnte spesifikk kvalitet bekymring, utvinningsgraden, har faktisk overraskende blitt minimert i publiserte rapporter; Dette gjøres ved generelt å skjule ugunstig utfall (dvs. tapt embryo eller egg) i typisk-god overlevelse. Alle enheter utsatt for inkonsekvent recovery (<99%) er alvorlig feil og utgjør en saksbehandlingsansvar.
Vår aseptisk, lukket iS-VTF metoden er strategisk utviklet for å ta hensyn til hver kvalitetskontroll tiltak. Men etter 5 år med overlegen klinisk suksess og validering 14, prosedyren hadde to være endret. De opprinnelige 0,3 ml embryo sugerør (som har et hydrofobt plugg) ble fjernet fra IVF industri og erstattet med en 0,3-ml sæd halm som innehar en standard bomull / PVP plugg (dvs. relabeled som et sæd / embryo halm). Denne prosessuelle papir skisserer konkrete tiltak og strategier for å implementere uS-VTF trygt, enkelt og effektivt. Videre, merker vi modifiseringen (e) som er nødvendig for pålitelig å gjøre rede for forsyning begrensninger, inntil slik tid som et alternativ ideell halm beholderen gjeninnføres tilbake inn i det kliniske laboratorium.
I dag er det en stor forventning om å oppnå fullstendig blastocyst overlevelse (> 95%) og å oppnå implantering suksess lik den til friske embryoer. Noen grupper har antydet at de levende fødselsratene vitrified embryo transfer sykluser er kanskje enda høyere enn fersk blastocysts når intakt cryokonservert embryoet er transplantert inn i en sunn, ikke-hormonelt-stimulert livmor. Våre data viser tydelig at forglassing effektivt og pålitelig opprettholder levedyktigheten av den friske embryo. Videre har vi bevist at vår aseptisk, lukket metode, kalt MicroSecure Forglassing (uS-VTF), kan oppnå en optimal resultat sammenlignes med eller større enn de kommersielle standarder (dvs. åpne enhets systemer) som brukes i IVF bransjen.
Variasjon er forbundet med teknisk repeterbarhet og pålitelighet mellom personer som bruker et mangfold av forglassing enheter / metoder. I sin tur, har dette resultert i inconsistencies mellom programmer søker vitrification. Derfor er det ikke overraskende at enheten fortrolighet er en viktig faktor med hensyn laboratorium ferdigheter og vellykkede resultater. Det er dette begrepet "teknisk signatur" 11 som forklarer hvorfor repeterbarhet mellom programmer kan være problematisk. Ikke bare har utviklingen av mer enn et dusin kommersielle enheter komplisert dette fenomenet, er det skapt kvalitetskontroll bekymringer. Heldigvis lukket forglassing systemer, som iS-VTF, Rapid-I, og VitriSafe, blir nå vist seg å være like effektive for å åpne enhetssystemer 12, 13, 14.
MicroSecure VTF er en roman, aseptisk Vitrifisering teknikk utviklet med tekniske problemer, pålitelighet og cryo-sikkerhet i tankene. Ved å kombinere bruken av to tidligere godkjent, FDA-kompatible enheter, er det en ikke-kommersiell vitrification system wed den klare fordelen av å ha en etablert lav pris, i motsetning til spesialiserte enheter. I tillegg har den unike fikle og internalisert tofarget merkeordningen, samt mange andre kvalitetskontroll fordeler, laget iS-VTF en attraktiv global alternativ 11. Som en ikke-kommersiell VTF-enhet, men er utbredt industrien søknad utvikling sakte. Bare gjennom den fortsatte utgivelsen av sin sikkerhet, sikkerhet og klinisk effektivitet vil iS-VTF gevinst økende utnyttelse.
I august 2014, da møtt med manglende evne til å tilegne seg den opprinnelige 0,3-ml embryo halm produsert med en indre, ikke-fukttransporterende hydrofob plugg, kunne vi sikkert endre iS-VTF-metoden. Kort sagt, ble den nye 0,3-ml sæd / embryo sugerør med sine bomull-PVP plugger effektivt tilpasset. Dette ble bare oppnås ved å skape en indre forsegling før bomull pluggen, og dermed hindrer kontakt og væskefukttransporterende medopen-ended VTF tips (dvs. flexipette inneholder embryo eller egg). Videre, hvis 40 mm ID-stenger er ikke tilgjengelig, oppdriften problemet forbundet med de lettere 30 mm stenger kan motvekt ved hjelp av to kulelagre.
Disse ytterligere trinn er gjort teknikken litt mindre enkel, men likevel meget effektiv. I dag, økonomi og effektivitet blir stadig viktige spørsmål, som biopsied blastocysts vanligvis vitrified individuelt inntil deres euploidy status er bekreftet på en genetikk rapport. Blastocyster med en bekreftet ikke-levedyktig Aneuploidy status typisk bli forkastet, med pasientens samtykke, i løpet av uker. Dermed er et flertall (> 50%) av VTF enheter kasseres etter kort tids lagring, forårsaker en eskalerende årlige kostnaden ved bruk av kommersielle enheter. Totalt sett er iS-VTF en svært effektiv, pålitelig og repeterbar prosedyre for nedfrysing av menneskelige blastocyster. Den overlegne kvaliteten-kontroll design securely etiketter og trygt lagrer embryo / ubefruktede egg mens de eliminerer utvinning svikt og optimalisering av post-oppvarming overlevelse og levedyktighet, som rettferdiggjør systemets bruk som en universell tilnærming til embryo forglassing.
The authors have nothing to disclose.
MC Schiewe vil takke Mr. Forest Garner ved Fertility Center of Las Vegas for sin statistisk kompetanse i å analysere og vurdere årlige CDC og SART data. Også forfatterne ønsker å takke sine Medisinsk direktør, Dr. Robert E. Anderson, for hans dedikert støtte og tro på våre tekniske ferdigheter og kompetanse.
Aluminum Cane | IVM | XC055 | ||||
Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel | |||
CBS semen/embryo straw, 0.3ml | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile | |||
Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted | |||
Culture tubes, 15ml | Falcon | 352099 | Conical | |||
Culture tubes, 10ml | Falcon | 352057 | Snap-cap | |||
Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | ||||
Filter, 250ml | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm | |||
Flasks, Tissue Culture 50ml | Falcon | 353014 | ||||
Flexipettes, 300μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack | |||
Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | ||||
Forcep,Splinter – fine | Miltex | 17-305 | ||||
Goblet | IVM | PA003 | ||||
Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110V or 220V with adapter | |||
Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100ml | with non-essential AA's | ||||
Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors | |||
Liquid Nitrogen Tank, 40L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage | |||
LN2 Dewar flask, 0.5L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel | |||
6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case | |||
Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex | |||
Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351006 | ||||
Petri Dishes, 58mm | Nunc | 150288 | ||||
Petri Dishes, 100mm | Falcon | 351029 | ||||
Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10-100μl | |||
Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable | |||
Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | ||||
Pipettes, Serological 1ml | Falcon | 357521 | ||||
Pipettes, Serological 2ml | Falcon | 357507 | ||||
Pipettes, Serological 5ml | Falcon | 357543 | ||||
Pipettes, Serological 10ml | Falcon | 357551 | ||||
Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | ||||
Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | ||||
Sterile Gauze pads, 4"x4" | Kendall Healthcare | 6939 | ||||
Synthetic serum | Life Global or | LGPS-20 ; 20ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10ml | purchase low endotoxin lot | ||||
Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50ml flasks, 1year | |||
17.1g/flask +Medium to 50ml | ||||||
makes a 1M solution | ||||||
Filter with 0.22µm unit | ||||||
Timer | Nalgene | 5016-001 | ||||
Thawing Solution | Innovative | BL-TS | T1, T2, T3, T4 | |||
Cryo Enterprises | (≤1.0M Sucrose) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
Vitrification Solution*,** | Innovative | BL-VS | V1, V2, V3 | |||
Cryo Enterprises | (≥7.9M [Glycerol/EG]) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | ||||||
** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. |