MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.
Clínica vitrificação embrião evoluiu com o desenvolvimento de dispositivos de vitrificação únicas no século 21 e com o equívoco de que o resfriamento ultra-rápida em um sistema "aberto" (ou seja, direta LN 2 contato) era uma necessidade para otimizar o sucesso vitrificação. O dogma em torno da importância de taxas de resfriamento levou a práticas inseguras sujeitas à variação técnica e à criação de dispositivos de vitrificação, que desrespeitam importantes fatores de controle de qualidade (por exemplo, facilidade de uso, repetibilidade, a fiabilidade, segurança rotulagem, segurança e armazenamento). Compreender as falhas de outros dispositivos permitidos para o desenvolvimento de um método de uS-VTF segura, segura, repetível e confiável teve como objetivo minimizar a variação intra e inter-técnico de controle de qualidade. Igualmente importante, ele combinou a disponibilidade de dois dispositivos FDA compatíveis existentes: 1) a ionom�ico palha resina embrião de 0,3 mL com internalizado, de duas cores, adulterar-protulagem telhado com potencial de solda da vedação repetível; e 2) encurtado, comumente utilizado, de 300 uM ID flexipettes estéreis para carregar directamente o embrião (s), a fim de criar um dispositivo de vitrificação global altamente eficaz. À semelhança de outros asséptica, fechou sistemas de vitrificação (por exemplo, alta Vitrificação de Segurança (HSV), Rapid-i, e VitriSafe) efetivamente usada na medicina reprodutiva, microSecure Vitrificação (uS-VTF) provou que ele pode atingir uma alta de sobrevivência pós-aquecimento e gravidez resultados com a sua atenção para a simplicidade, e reduziu a variação técnica. Embora a palha embrião 0,3 ml, contendo uma ficha interna hidrofóbica foi comercialmente substituído com uma palha sémen padrão possuindo pirrolidona algodão de polivinil (PVP) plugs, manteve a sua composição de resina ionom�ico para garantir a vedação de solda. No entanto, os tampões de algodão pode pavio o conteúdo fluido-embrião do flexipettes em cima do contato. Um método uS-VTF modificado foi adaptado para incluir uma soldadura interna adicionalselar antes de o bujão no lado do dispositivo de carregamento. A etapa técnica adicionado ao procedimento de uS-VTF não afetou sua aplicação bem-sucedida, as taxas de sobrevivência tão elevadas (> 95%) e as taxas de gravidez continuam até hoje.
A vitrificação é a tecnologia assistida maior impacto único reprodutiva na indústria de fertilização in vitro (FIV) desde o desenvolvimento da injeção intracitoplasmática de espermatozóides. Hoje, os blastocistos são criopreservadas sem a perda na viabilidade do embrião anteriormente associado com métodos slow-congelação convencionais 1. Com sobrevivência embrionária pós-aquecimento confiável, a indústria da infertilidade está se transformando em o uso preferencial de ciclos de transferência de embriões criopreservados, que produzem os resultados da gravidez semelhantes ou mais elevados do que a transferência de embrião tradicional fresco. Em associação com a biópsia do blastocisto e rastreio genético pré-implantação (PGS), vitrificação tornou-se uma ferramenta clínica vital para otimizar os resultados de nascidos vivos saudáveis através euploid única transferência do embrião 2, 3.
Vitrificação embrião murino foi desenvolvido em meados dos anos 1980 4, </sup> 5 e adaptado para agricultura animal até 1990 6. Com base na premissa de que as soluções de vitrificação formar um estado metaestável glasseous, livre de danificar a formação de cristais de gelo, que tem provado mais eficientemente preservar a integridade celular completa de embriões. Curiosamente, a aceitação promissora de vitrificação em embriologia humana não começou a ser realizado até o século 21. Publicações antigas que promovem o uso de vitrificação coincidiu com o desenvolvimento de originais "abertos" os dispositivos do sistema 7, 8, 9. No entanto, a adoção de vitrificação para a prática clínica foi lento, como veio num momento em que melhorias no congelamento lento blastocisto foram ocorrendo também. Bem sucedido convencional de congelamento de taxa lenta, em adição à vitrificação, foram alinhadas com melhoramentos em sistemas de cultura de embriões, assim como com a incorion de abordagens blastocele-colapso, o que aumentou tanto a sobrevida global dos trofectoderma e, posteriormente, o implante 10.
Na última década, a tecnologia de vitrificação suplantou rapidamente práticas de congelamento convencionais. Em grande medida, isso deveu-se ao desenvolvimento de dispositivos de vitrificação especializados. Alguns destes dispositivos têm prejudicado a segurança global, eficiência e eficácia da vitrificação clínica através da introdução de falhas de projeto inerentes aos dispositivos utilizados na indústria de fertilização in vitro 11. Na verdade, as nuances de diferentes dispositivos introduzir variação técnico significativo entre os programas, comumente referido como "assinaturas técnicas" 12. Assim, revistas científicas, como o Journal of Experiments visualizados (JoVE), pode servir como um recurso valioso para demonstrar detalhes técnicos, o que ajudará a reduzir a variação resultado. Outro problema permanente é que éome embriologistas continuam a ser mal informado, ainda hoje, com base em alegações de que o "arrefecimento ultra-rápida de embriões ou ovócitos em um" sistema de vitrificação aberto "(ou seja, o contato embrião direto com azoto líquido (LN 2)) é um pré-requisito para otimizar taxas de sucesso. " Claramente, esta crença é impreciso, com base no sucesso comprovado de asséptica sistemas 13, 14, 15 fechado.
Com base nos princípios cryobiological de vitrificação, a eficácia da vitrificação é mais altamente dependente taxas de aquecimento do que sobre as taxas de 16, 17, 18 de arrefecimento. De um modo geral, independente do dispositivo de vitrificação utilizado, a taxa de aquecimento deve exceder a taxa de arrefecimento para assegurar altas taxas de sobrevivência. Taxas de aquecimento elevadas minimizar a oportunidade para qualquer crescimento do gelo (ou seja, o recrystallization de impurezas nucleadas em crio soluções) durante a fase de devitrification do aquecimento. Concedida, a estabilidade da solução de vitrificação (ou seja, o tipo e concentração de agentes crioprotectores utilizados) podem ter um efeito de confusão, mas esta é tratada em uma publicação separada 11. Considerando as questões de taxa de refrigeração-aquecimento, MicroSecure de vitrificação (uS-VTF) foi desenvolvido em 2008 como um método barato, não-comercial, FDA-compliant que otimizou os aspectos da vitrificação de controle de qualidade. Era o único que ofereceu à prova de violação, internalizado, a rotulagem de duas cores. Além disso, através do carregamento e o armazenamento dos embriões directamente no flexipette estéril usada para pipetagem (isto é, sem pipetagem para uma superfície de dispositivo secundário) e usando palhetas ionomérico-resina que vedam completamente solda utilizando um aferidor automatizado, variação técnica tem sido eficazmente eliminada.
Ao avaliar a completeness de dispositivos de vitrificação para uso potencial, existem vários fatores de controle de qualidade que devem ser levadas em consideração, incluindo: 1) A rotulagem potenciais etiquetas -Pode ser firmemente aderido? elas são à prova de falsificação? Será que eles oferecem duas cores potencial de identificação? Ele exige um rótulo secundário, e pode o rótulo ser facilmente removido para fins de manutenção de registros (ou seja, o paciente verificação) pós-aquecimento? 2) facilidade técnica embriões -Pode ser facilmente carregado no / para o dispositivo de uma forma atempada e simplesmente identificadas e rastreadas pós-aquecimento? 3) Processo simplicidade / repetibilidade -Será que o método de vitrificação oferta simplicidade e confiabilidade que facilmente permite a repetibilidade, o que minimiza a variação entre técnicos (internos) e programas (externos)? 4) LN 2 capacidade de armazenamento -Pode os dispositivos ser facilmente e com segurança tratadas e identificadas? É sua storaiva espaço potencial eficiente? Será que o dispositivo de oferta de segurança e protecção contra danos físicos ou possíveis contaminantes como um sistema fechado asséptica? 5) Potencial de Recuperação / sobrevivência -É o projeto do dispositivo propenso a potenciais problemas na recuperação garantida de embriões, e que de forma confiável vitrificar e manter completa integridade celular pós-aquecimento? A última preocupação determinada qualidade, a taxa de recuperação, foi efectivamente surpreendentemente minimizado em relatórios publicados; isso é feito geralmente escondendo o desfecho desfavorável (ou seja, embrião perdido ou ovo) em tipicamente boas taxas de sobrevivência. Qualquer dispositivo propenso a recuperação inconsistente (<99%) está seriamente errado e constitui um passivo processual.
Nossa asséptica, fechou método uS-VTF foi estrategicamente desenvolvido para explicar cada medida de controle de qualidade. No entanto, após 5 anos de sucesso clínico superior e validação 14, o procedimento teve to ser modificado. As palhetas de embrião de 0,3 mL originais (que possuem um tampão hidrofóbico) foram removidos da indústria de FIV e substituído com um canudo de sémen 0,3 mL possuindo um tampão de algodão / PVP padrão (isto é, sémen renomeado como uma palha / embrião). Este artigo descreve as etapas processuais e estratégias específicas necessárias para implementar uS-VTF de forma segura, simples e eficaz. Além disso, destaca-se a modificação (s) necessária para dar conta de forma confiável por limitações de fornecimento, até o momento em um recipiente de palha alternativa ideal é reintroduzido de volta para o laboratório clínico.
Hoje em dia, existe uma elevada expectativa de alcançar a sobrevivência blastocisto completa (> 95%) e alcançar o sucesso semelhante ao implante de embriões frescos. Alguns grupos têm sugerido que as taxas de nascidos vivos de ciclos de transferência de embriões vitrificadas são talvez ainda mais elevados do que os blastocistos fresco quando o embrião criopreservado intacta é transplantado para um útero saudável, não-estimulada hormonalmente. Os nossos dados indicam claramente que a vitrificação eficaz e fiável mantém a viabilidade do embrião fresco. Além disso, provámos que a nossa asséptica, método fechado, chamado MicroSecure de vitrificação (uS-VTF), pode conseguir uma optimização dos resultados comparáveis ou superiores aos padrões comerciais (isto é, sistemas de dispositivo abertos) utilizados na indústria de FIV.
Variação está associada com repetibilidade técnica e confiabilidade entre os indivíduos usando uma infinidade de vitrificação dispositivos / métodos. Por sua vez, isso resultou em inconsistencies entre os programas de aplicação de vitrificação. Portanto, não é surpreendente que dispositivo de familiaridade é um fator importante a respeito de proficiência laboratorial e resultados bem sucedidos. É este conceito de "assinatura técnica" 11 que explica por que a repetibilidade entre programas pode ser problemático. Não só o desenvolvimento de mais do que uma dúzia de dispositivos comerciais complicado este fenómeno, que criou preocupações de controle de qualidade. Felizmente, fechou sistemas de vitrificação, como uS-VTF, Rapid-I, e VitriSafe, estão agora a revelar-se igualmente eficaz para abrir sistemas de dispositivo de 12, 13, 14.
MicroSecure VTF é um romance, técnica de vitrificação asséptica desenvolvida com facilidade técnica, confiabilidade e crio-segurança em mente. Ao combinar a utilização de dois dispositivos previamente aprovados pela FDA,-compatíveis, que é um sistema de vitrificação não comercial Wom a vantagem de ter um baixo custo estabelecido, em contraste com dispositivos especializados. Além disso, sua inviolável única e sistema de rotulagem de duas cores internalizado, bem como inúmeras outras vantagens de controle de qualidade, fizeram uS-VTF uma opção global atraente 11. Como um dispositivo de VTF não-comercial, no entanto, a sua aplicação generalizada indústria está evoluindo lentamente. Só através da publicação contínua da sua segurança, segurança e eficácia clínica vai ganhar uS-VTF utilização crescente.
Em agosto de 2014, quando confrontados com a incapacidade de adquirir o original palha embrião de 0,3 mL fabricado com um non-wicking plugue interior, hidrofóbico, fomos capazes de modificar de forma confiável o método uS-VTF. Em suma, os novos sêmen de 0,3 mL / palhas embrião com seus tampões de algodão-PVP foram efetivamente adaptada. Isto foi simplesmente alcançado através da criação de um selo interno antes do tampão de algodão, evitando assim o contacto e fluido de drenagem com oponta VTF aberto (ou seja, o flexipette contendo o embrião ou ovos). Além disso, se 40-mm hastes de identificação não são acessíveis, o problema associado com a flutuabilidade das hastes mais leves de 30 mm pode ser counterweighted usando dois rolamentos de esferas.
Estes passos adicionais fizeram a técnica um pouco menos simples, mas ainda altamente eficaz. Hoje, economia e eficácia estão se tornando cada vez mais preocupações importantes, como blastocistos biopsiados são tipicamente vitrificados individualmente até o seu estado euploidy é confirmado em um relatório genética. Blastocistos com um estatuto de aneuploidia não viáveis confirmou normalmente descartadas, com o consentimento do paciente, dentro de algumas semanas. Assim, a maioria (> 50%) dos dispositivos de VTF são descartados após um armazenamento de curto termo, causando um custo anual crescente na utilização de dispositivos comerciais. No geral, uS-VTF é um procedimento altamente eficaz, confiável e repetível para a criopreservação de blastocistos humanos. O securel projeto de controle de qualidade superioretiquetas y e segura armazena embriões / ovócitos ao eliminar a falha de recuperação e otimizar a sobrevivência pós-aquecimento e viabilidade, o que justifica o uso do sistema como uma abordagem universal para a vitrificação de embriões.
The authors have nothing to disclose.
MC Schiewe gostaria de agradecer ao Sr. Floresta Garner no Centro de Fertilidade de Las Vegas para sua perícia estatística na análise e avaliação dos dados anuais do CDC e SART. Além disso, os autores gostariam de agradecer o seu diretor médico, Dr. Robert E. Anderson, por seu apoio dedicado e fé nas nossas capacidades e conhecimentos técnicos.
Aluminum Cane | IVM | XC055 | ||||
Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel | |||
CBS semen/embryo straw, 0.3ml | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile | |||
Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted | |||
Culture tubes, 15ml | Falcon | 352099 | Conical | |||
Culture tubes, 10ml | Falcon | 352057 | Snap-cap | |||
Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | ||||
Filter, 250ml | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm | |||
Flasks, Tissue Culture 50ml | Falcon | 353014 | ||||
Flexipettes, 300μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack | |||
Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | ||||
Forcep,Splinter – fine | Miltex | 17-305 | ||||
Goblet | IVM | PA003 | ||||
Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110V or 220V with adapter | |||
Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100ml | with non-essential AA's | ||||
Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors | |||
Liquid Nitrogen Tank, 40L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage | |||
LN2 Dewar flask, 0.5L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel | |||
6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case | |||
Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex | |||
Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351006 | ||||
Petri Dishes, 58mm | Nunc | 150288 | ||||
Petri Dishes, 100mm | Falcon | 351029 | ||||
Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10-100μl | |||
Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable | |||
Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | ||||
Pipettes, Serological 1ml | Falcon | 357521 | ||||
Pipettes, Serological 2ml | Falcon | 357507 | ||||
Pipettes, Serological 5ml | Falcon | 357543 | ||||
Pipettes, Serological 10ml | Falcon | 357551 | ||||
Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | ||||
Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | ||||
Sterile Gauze pads, 4"x4" | Kendall Healthcare | 6939 | ||||
Synthetic serum | Life Global or | LGPS-20 ; 20ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10ml | purchase low endotoxin lot | ||||
Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50ml flasks, 1year | |||
17.1g/flask +Medium to 50ml | ||||||
makes a 1M solution | ||||||
Filter with 0.22µm unit | ||||||
Timer | Nalgene | 5016-001 | ||||
Thawing Solution | Innovative | BL-TS | T1, T2, T3, T4 | |||
Cryo Enterprises | (≤1.0M Sucrose) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
Vitrification Solution*,** | Innovative | BL-VS | V1, V2, V3 | |||
Cryo Enterprises | (≥7.9M [Glycerol/EG]) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | ||||||
** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. |