MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.
Clínica vitrificación de embriones evolucionado con el desarrollo de dispositivos de vitrificación únicas en el siglo 21 y con la idea errónea de que el enfriamiento ultrarrápido en un sistema "abierto" (es decir, directa LN 2 de contacto) era una necesidad para optimizar el éxito de vitrificación. El dogma que rodea a la importancia de las velocidades de enfriamiento dio lugar a prácticas inseguras están sujetos a variación técnica y para la creación de dispositivos de vitrificación que desatendieron importantes factores de control de calidad (por ejemplo, la facilidad de uso, la repetibilidad, fiabilidad, seguridad etiquetado, seguridad y almacenamiento). La comprensión de los defectos de control de calidad de otros dispositivos permitidos para el desarrollo de un método mS-VTF seguro, seguro, repetible y fiable basado en la minimización de variación intra e inter-técnico. Igualmente importante es que combina la disponibilidad de dos dispositivos compatible con la FDA existentes: 1) un ionómero de paja embrión resina de 0,3 mL con interiorizado, de dos colores, manipulaciones petiquetado azotea con potencial sello soldado repetible; y 2) acortada, comúnmente utilizado, ID 300-m flexipettes estériles para cargar directamente el embrión (s) con el fin de crear un dispositivo de vitrificación global altamente eficaz. Al igual que otros aséptica, se cerraron los sistemas de vitrificación (por ejemplo, alta seguridad de vitrificación (HSV), Rapid-i, y VitriSafe) utilizado con eficacia en medicina reproductiva, microSecure vitrificación (mS-VTF) ha demostrado que puede lograr una alta supervivencia post-calentamiento y el embarazo los resultados con su atención a la simplicidad, y la reducción de la variación técnica. Aunque la paja embrión 0,3 ml que contenía un tapón hidrófobo interno fue sustituido en el comercio con una paja semen estándar que posee pirrolidona algodón de polivinilo (PVP) tapones, mantuvo su composición de resina de ionómero de garantizar el sellado de soldadura. Sin embargo, los tapones de algodón pueden absorber el contenido de líquido embrión de la flexipettes al entrar en contacto. Un método mS-VTF modificado fue adaptado para incluir una soldadura interna adicionalsellar antes de que el enchufe en el lado de carga del dispositivo. El paso técnico incluido en el procedimiento mS-VTF no ha afectado a su aplicación con éxito, como altas tasas de supervivencia (> 95%) y las tasas de embarazo continuará hoy.
La vitrificación es la tecnología asistida más impactante sola reproductiva en la industria de la fertilización in vitro (IVF) ya que el desarrollo de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Hoy en día, los blastocistos son criopreservados sin la pérdida de la viabilidad de los embriones previamente asociados con los métodos convencionales de congelación lenta-1. Con la supervivencia embrionaria post-calentamiento fiable, la industria de la infertilidad se está transformando en el uso preferente de los ciclos de transferencia de embriones criopreservados, que producen los resultados del embarazo similares o superiores tradicional de transferencia de embriones frescos. En asociación con la biopsia de blastocisto y el cribado genético preimplantacional (DGP), la vitrificación se ha convertido en una herramienta clínica fundamental para optimizar los resultados de nacidos vivos sanos a través de la transferencia de embriones euploid solo 2, 3.
Vitrificación de embriones murino fue desarrollado a mediados de la década de 1980 4, </sup> 5 y adaptada a la ganadería en 1990 6. Partiendo de la premisa de que las soluciones de vitrificación forman un estado metaestable glasseous, libre de dañar la formación de cristales de hielo, se ha demostrado para preservar de manera más eficiente la integridad celular completa de embriones. Curiosamente, la aceptación prometedora de vitrificación en embriología humana no comenzó a hacerse realidad hasta el siglo 21. Las primeras publicaciones que promueven el uso de la vitrificación coincidieron con el desarrollo de los únicos dispositivos del sistema "abierto" 7, 8, 9. Sin embargo, la adopción de vitrificación en la práctica clínica fue lenta, ya que se produjo en un momento en que las mejoras en la congelación de blastocisto lenta también se estaban produciendo. El éxito de la congelación-velocidad lenta convencional, además de la vitrificación, fueron alineadas con las mejoras en los sistemas de cultivo de embriones, así como con la Incorporation de enfoques colapso blastocele, que mejora tanto la supervivencia global de trophectoderm y, posteriormente, la implantación 10.
En la última década, la tecnología de vitrificación ha suplantado rápidamente las prácticas convencionales de congelación. En gran medida, esto era debido al desarrollo de dispositivos de vitrificación especializados. Algunos de estos dispositivos han perjudicado la seguridad general, la eficiencia y la eficacia de la vitrificación clínica mediante la introducción de defectos inherentes de diseño para dispositivos utilizados en la industria de la fertilización in vitro 11. De hecho, los matices de los diferentes dispositivos de introducir una variación significativa entre los programas técnicos, comúnmente conocida como "firmas técnicas" 12. De este modo, revistas científicas, como el Diario de experimentos visualizados (JoVE), pueden servir como un recurso valioso para la demostración de los detalles técnicos, lo que ayudará a reducir la variación del resultado. Otro problema es que s en cursoome embriólogos siguen siendo mal informado, incluso hoy en día, en base a las afirmaciones de que el "enfriamiento ultrarrápido de embriones u ovocitos en un 'sistema de vitrificación abierto" (es decir, el contacto embrión directa con nitrógeno líquido (LN 2)) es un requisito previo para la optimización las tasas de éxito ". Claramente, esta creencia es errónea, basada en el éxito probado de sistemas aséptica 13, 14, 15 cerrados.
Sobre la base de los principios criobiológicos de vitrificación, la eficacia de la vitrificación es más altamente dependiente de las tasas de calentamiento que en las tasas de 16, 17, 18 de refrigeración. En general, independiente del dispositivo de vitrificación utilizado, la tasa de calentamiento debe ser superior a la velocidad de enfriamiento para asegurar altas tasas de supervivencia. Altas tasas de calentamiento reducen al mínimo la posibilidad de cualquier crecimiento del hielo (es decir, la recrystallization de impurezas nucleadas en la crio-solutions) durante la fase de calentamiento de la desvitrificación. Por supuesto, la estabilidad de la solución de vitrificación (es decir, el tipo y la concentración de agentes crioprotectores utilizados) puede tener un efecto de confusión, pero esto se abordan en una publicación separada 11. Teniendo en cuenta los problemas de las tasas de calentamiento experimenta enfriamiento, MicroSecure de vitrificación (mS-VTF) fue desarrollado en 2008 como un método barato, no comercial, compatible con la FDA que optimiza los aspectos de control de calidad de la vitrificación. Era único en que se ofreció a prueba de falsificaciones, interiorizado, el etiquetado de dos colores. Por otra parte, por la carga y el almacenamiento de los embriones directamente en el flexipette estéril utilizado para el pipeteado (es decir, sin la pipeta a una superficie del dispositivo secundario) y mediante el uso de pajitas de ionómero de resina que sellan completamente de soldadura utilizando un sellador automatizado, variante técnica se ha eliminado efectivamente.
Al evaluar la completeness de dispositivos de vitrificación para su posible uso, hay varios factores de control de calidad que se deben tener en cuenta, entre ellos: 1) marcar posibles etiquetas -Se puede adherir de forma segura? Están a prueba de manipulaciones? ¿Ofrecen el potencial de identificación de dos colores? ¿Es necesaria una etiqueta secundaria, y la etiqueta se puede quitar fácilmente para fines de mantenimiento de registros (es decir, la verificación del paciente) post-calentamiento? 2) facilidad técnica embriones -Se puede cargar fácilmente en / sobre el dispositivo de una manera oportuna y simplemente identificados y rastreados post-calentamiento? 3) simplicidad de procedimiento / Repetibilidad -¿La método de vitrificación oferta simplicidad y fiabilidad que permite facilidad de repetibilidad, lo que minimiza la variación entre técnicos (internos) y programas (externos)? 4) 2 LN capacidad de almacenamiento de los dispositivos -¿Puede ser manejado e identificado fácilmente y con seguridad? Sto es surabia espacio potencial eficiente? ¿Ofrece el dispositivo de seguridad y la seguridad de cualquier daño físico o posibles contaminantes como un sistema cerrado aséptico? 5) el potencial de recuperación / Supervivencia -Es el diseño de dispositivos propensos a problemas potenciales en la recuperación garantizada de embriones, y van a vitrificar fiable y mantener la integridad celular post-calentamiento completa? La última preocupación específica a la calidad, la tasa de recuperación, ha sido realmente sorprendente minimizado en los informes publicados; esto se hace por lo general que oculta el resultado desfavorable (es decir, embrión perdido o huevo) en típicamente buenas tasas de supervivencia. Cualquier dispositivo propensos a la recuperación inconsistente (<99%) es seriamente defectuoso y constituye un pasivo de procedimiento.
Nuestra aséptica, cerrado método mS-VTF ha sido diseñada estratégicamente para dar cuenta de cada medida de control de calidad. Sin embargo, después de 5 años de éxito clínico superior y 14 de validación, el procedimiento tenía tO sea modificado. Las pajas de embrión de 0,3 mL originales (que poseen un tapón hidrófobo) se retiraron de la industria de la fertilización in vitro y se sustituye con una paja semen 0,3 ml que posee un tapón de algodón / PVP estándar (es decir, re-etiquetado como semen / paja de embriones). En este documento se describen los pasos de procedimiento y estrategias específicas que se necesitan para poner en práctica mS-VTF de forma segura, sencilla y eficaz. Por otra parte, destacamos la modificación (s) que se necesita para tener en cuenta las limitaciones de suministro fiable de, hasta el momento en un contenedor de paja ideales alternativa se vuelve a introducir de nuevo en el laboratorio clínico.
Hoy en día, existe una gran expectativa de lograr la supervivencia de blastocisto completa (> 95%) y alcanzar el éxito de la implantación similar a la de embriones frescos. Algunos grupos han sugerido que las tasas de nacidos vivos de los ciclos de transferencia de embriones vitrificados son quizás incluso más alto que los blastocistos frescos cuando el embrión intacto criopreservados se trasplanta en un útero sano, estimulado no hormonalmente. Nuestros datos indican claramente que la vitrificación mantiene de manera eficaz y fiable la viabilidad del embrión fresco. Además, hemos demostrado que nuestro aséptica, método cerrado, llamado MicroSecure vitrificación (mS-VTF), puede lograr un resultado óptimo comparable o superior a los estándares comerciales (es decir, sistemas de dispositivos abiertos) utilizados en la industria de la fertilización in vitro.
La variación se asocia con la repetibilidad técnica y fiabilidad entre las personas que utilizan una multitud de dispositivos / vitrificación métodos. A su vez, esto ha dado lugar a inconsistencies entre los programas de la aplicación de la vitrificación. Por lo tanto, no es sorprendente que la familiaridad dispositivo es un factor importante en cuanto a la aptitud del laboratorio y los resultados exitosos. Es este concepto de "firma técnica" 11 que explica por qué la repetibilidad entre programas puede ser problemático. No sólo el desarrollo de más de una docena de dispositivos comerciales complican este fenómeno, se ha creado problemas de control de calidad. Afortunadamente, los sistemas cerrados de vitrificación, como mS-VTF, Rapid-I, y VitriSafe, ahora están demostrando ser igualmente eficaz para abrir los sistemas de dispositivos 12, 13, 14.
MicroSecure VTF es una novela, técnica de vitrificación aséptica desarrollado con facilidad técnica, la fiabilidad y la crio-seguridad en mente. Mediante la combinación de la utilización de dos dispositivos aprobados previamente, compatible con la FDA, es un sistema de vitrificación no comercial wITH la ventaja de tener un bajo costo establecido, en contraste con los dispositivos especializados. Además, su único y prueba de manipulaciones sistema de etiquetado de dos colores interiorizado, así como numerosas otras ventajas de control de calidad, han hecho mS-VTF una atractiva opción global 11. Como dispositivo de VTF no comercial, sin embargo, su aplicación generalizada de la industria está evolucionando lentamente. Sólo a través de la publicación continua de su seguridad, la seguridad y la eficacia clínica ganará mS-VTF utilización cada vez mayor.
En agosto de 2014, ante la imposibilidad de adquirir el original paja embriones de 0,3 ml fabricado con un tapón hidrófobo interno, no absorbe, hemos sido capaces de modificar de forma fiable el método mS-VTF. En resumen, las nuevas semen de 0,3 ml / pajuelas de embriones con sus tapones de algodón-PVP fueron adaptados de manera efectiva. Esto se consigue simplemente mediante la creación de un sello interno antes de que el tapón de algodón, evitando así el contacto y el líquido que absorbe laVTF punta de composición abierta (es decir, la flexipette que contiene el embrión o los huevos). Además, si las barras de identificación 40 mm no son accesibles, la cuestión de flotación asociado con las barras más ligeras 30 mm se puede contrapesos mediante dos rodamientos de bolas.
Estos pasos adicionales han hecho de la técnica ligeramente menos simple, pero todavía muy eficaz. Hoy en día, la economía y la eficacia son cada vez más importantes preocupaciones, como blastocistos biopsiados son típicamente vitrificados individualmente hasta su estado euploidy se confirma en un informe de la genética. Los blastocistos con una aneuploidía no viable confirmado normalmente se descartan, con el consentimiento del paciente, en cuestión de semanas. Por lo tanto, una mayoría (> 50%) de los dispositivos de VTF se descartan después de almacenamiento a corto plazo, provocando un costo anual escalada cuando se utilizan dispositivos comerciales. En general, mS-VTF es un procedimiento altamente eficaz, fiable y repetible para la criopreservación de blastocistos humanos. El superior de control de calidad de diseño securelY etiquetas y segura almacena los ovocitos / embriones al tiempo que elimina la falta de recuperación y optimizar la supervivencia post-calentamiento y la viabilidad, lo que justifica el uso del sistema como un enfoque universal a la vitrificación de embriones.
The authors have nothing to disclose.
MC Schiewe quisiera agradecer al Sr. Bosque Garner en el Centro de Fertilidad de Las Vegas por su experiencia estadística en el análisis y evaluación de los datos anuales de los CDC y SART. Además, los autores desean agradecer a su director médico, el Dr. Robert E. Anderson, por su dedicado apoyo y la fe en nuestras capacidades técnicas y experiencia.
Aluminum Cane | IVM | XC055 | ||||
Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel | |||
CBS semen/embryo straw, 0.3ml | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile | |||
Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted | |||
Culture tubes, 15ml | Falcon | 352099 | Conical | |||
Culture tubes, 10ml | Falcon | 352057 | Snap-cap | |||
Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | ||||
Filter, 250ml | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm | |||
Flasks, Tissue Culture 50ml | Falcon | 353014 | ||||
Flexipettes, 300μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack | |||
Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | ||||
Forcep,Splinter – fine | Miltex | 17-305 | ||||
Goblet | IVM | PA003 | ||||
Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110V or 220V with adapter | |||
Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100ml | with non-essential AA's | ||||
Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors | |||
Liquid Nitrogen Tank, 40L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage | |||
LN2 Dewar flask, 0.5L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel | |||
6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case | |||
Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex | |||
Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351006 | ||||
Petri Dishes, 58mm | Nunc | 150288 | ||||
Petri Dishes, 100mm | Falcon | 351029 | ||||
Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10-100μl | |||
Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable | |||
Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | ||||
Pipettes, Serological 1ml | Falcon | 357521 | ||||
Pipettes, Serological 2ml | Falcon | 357507 | ||||
Pipettes, Serological 5ml | Falcon | 357543 | ||||
Pipettes, Serological 10ml | Falcon | 357551 | ||||
Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | ||||
Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | ||||
Sterile Gauze pads, 4"x4" | Kendall Healthcare | 6939 | ||||
Synthetic serum | Life Global or | LGPS-20 ; 20ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10ml | purchase low endotoxin lot | ||||
Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50ml flasks, 1year | |||
17.1g/flask +Medium to 50ml | ||||||
makes a 1M solution | ||||||
Filter with 0.22µm unit | ||||||
Timer | Nalgene | 5016-001 | ||||
Thawing Solution | Innovative | BL-TS | T1, T2, T3, T4 | |||
Cryo Enterprises | (≤1.0M Sucrose) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
Vitrification Solution*,** | Innovative | BL-VS | V1, V2, V3 | |||
Cryo Enterprises | (≥7.9M [Glycerol/EG]) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | ||||||
** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. |