MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.
Klinisk embryo förglasning utvecklats med utvecklingen av unika förglasning enheter i 21-talet och med missuppfattningen att ultra-snabb kylning i ett "öppet" system (dvs. direkt LN 2 kontakt) var en nödvändighet för att optimera vitrifiering framgång. Dogmen kring vikten av kylningshastigheter lett till osäkra metoder som är föremål för teknisk variation och till skapandet av förglasning enheter som lämnats utan avseende viktiga kvalitetskontroll faktorer (t.ex., användarvänlighet, repeterbarhet, tillförlitlighet, märkning säkerhet och lagring säkerhet). Förstå kvalitetskontroll brister i andra anordningar tillåts för utvecklingen av en säker, repeterbara och pålitliga iS-VTF metod som syftar till att minimera inom och mellan tekniker variation. Lika viktigt, kombinerat det tillgången på två befintliga FDA-kompatibla enheter: 1) en 0,3-ml jonomerharts embryo halm med internaliseras, dubbel-färgad, manipulera-ptak märkning med repeterbara svetstätning potential; och 2) förkortas vanligt förekommande, 300-um ID sterila flexipettes att direkt ladda embryot (s) för att skapa en mycket effektiv global vitrifiering enhet. Liksom andra aseptisk, stängd förglasning system (t.ex. High Security Förglasning (HSV), Rapid-I, och VitriSafe) effektivt användas i reproduktiv medicin, microSecure Förglasning (iS-VTF) har visat att det kan uppnå hög efter uppvärmningen överlevnad och graviditet utfall med sin uppmärksamhet på enkelhet och minskad teknisk variation. Även embryo halm 0,3 ml innehåller en intern hydrofoba kontakten var kommersiellt ersattes med en standard sperma halm som har bomull polyvinylpyrrolidon (PVP) pluggar, underhålls det dess jonomera hartskomposition för att säkerställa svets tätning. Emellertid kan de bomullsproppar suga ut fluid-embryo innehållet i flexipettes vid kontakt. En modifierad iS-VTF metoden anpassas för att inkludera en ytterligare intern svetstäta innan kontakten på enhetens lastsidan. Den tillsatta tekniska steg i iS-VTF förfarande har inte påverkat dess framgångsrik tillämpning, så höga överlevnad (> 95%) och graviditetsfrekvens fortsätter idag.
Förglasning är den enskilt mest effektfulla assisterad befruktning i in vitro-fertilisering (IVF) branschen sedan utvecklingen av intracytoplasmatisk spermieinjektion. Idag, blastocyster är frysförvarade utan förlust i embryo livskraft tidigare i samband med konventionella långsam frysning metoder 1. Med tillförlitlig efter uppvärmningen embryo överlevnad, är infertilitet industrin förvandlas till den föredragna användningen av frysförvarade embryon överföringscykler, som ger liknande eller högre pregnancyutfall än traditionell färsk embryoöverföring. I samband med blastocyst biopsi och preimplantatorisk genetisk screening (PGS) har förglasning blivit en viktig klinisk verktyg för att optimera friska levande födelse resultat via euploid enda embryo 2, 3.
Murin embryo förglasning utvecklades i mitten av 1980-talet 4, </sup> 5 och anpassas till djurhållning av 1990 6. Baserat på antagandet att förglasningslösningar bildar ett metastabilt glasseous tillstånd, fritt från skada iskristallbildning, har det visat sig att mer effektivt bevara fullständig cellulär integritet av embryon. Intressant nog gjorde lovande godkännande av förglasning i human embryologi inte börja realiseras förrän 21-talet. Tidiga publikationer som främjar användningen av förglasning sammanföll med utvecklingen av unika "öppna" systemenheter 7, 8, 9. Det var antagandet av vitrifiering i klinisk praxis långsam, eftersom det kom vid en tidpunkt när förbättringar i slow blastocyst frysning också förekommer. Framgångsrik konventionell långsam takt frysning, förutom vitrifiering, var i linje med förbättringar i embryokultursystem, samt med incorporation av blastocoele-kollapsande metoder, som förbättrade både den totala överlevnaden av trophectoderm och därefter implantation 10.
Under det senaste decenniet har förglasning teknik snabbt ersatt konventionella frysningsmetoder. Till stor del berodde detta på utvecklingen av specialiserade förglasning enheter. Vissa av dessa anordningar har handikappade den totala säkerheten, effektiviteten i kliniska förglasning genom att införa inneboende konstruktionsfel till enheter som används i IVF-industrin 11. I själva verket, nyanserna av olika enheter införa betydande teknisk variation mellan programmen, vanligen kallad "tekniska signaturer" 12. Således, vetenskapliga tidskrifter, som Journal of visualiseras experiment (JUPITER), kan fungera som en värdefull resurs för att demonstrera tekniska detaljer, vilket kommer att bidra till att minska resultatet variation. Ett annat pågående problem är att sissa embryologer fortsätter att felinformerad även i dag, baserat på påståenden som "ultra-snabb kylning av embryon eller ägg i en" öppen vitrifiering system "(det vill säga direkt embryo kontakt med flytande kväve (LN 2)) är en förutsättning för att optimera framgångsrika. " Uppenbarligen är denna tro felaktig, baserat på den beprövade framgång aseptiska slutna system 13, 14, 15.
Baserat på de cryobiological principerna för vitrifiering, är effektiviteten för förglasning mer i hög grad beroende uppvärmningen hastigheter än vid kylning satser 16, 17, 18. I allmänhet, oberoende av den förglasning anordningen används, måste uppvärmningshastigheten överstiger kylningshastigheten för att tillförsäkra en hög överlevnadsgrad. Höga uppvärmningen priser minimera möjligheten för någon is tillväxt (dvs Recrystallization av kärn föroreningar i Cryo-lösningar) under glaskristallisation fasen av uppvärmningen. Visst, kan stabiliteten hos förglasningslösning (dvs typen och koncentrationen av kryoskyddsmedel som används) har en förvirrande effekt, men detta behandlas i en separat publikation 11. Med tanke på de avkylnings värmande ränta frågor, var MicroSecure Förglasning (iS-VTF) utvecklades under 2008 som ett billigt, icke-kommersiella, FDA-kompatibel metod som optimerat kvalitetskontroll aspekter av vitrifiering. Det var unikt genom att det erbjuds manipuleringssäker, internaliseras, tvåfärgad märkning. Genom lastning och lagring av embryon direkt i den sterila flexipette används för pipettering (dvs utan pipettering till en sekundär enhet yta) och genom att använda jonomera harts sugrör som helt svetstätningen med en automatiserad sealer, teknisk variation faktiskt har eliminerats.
Vid bedömningen av completeness av förglasning anordningar för potentiell användning, det finns flera kvalitetskontroll faktorer som bör beaktas, inklusive: 1) märkning potentiella -Kan etiketter säkert följas? Är de manipulerings? Har de erbjuder tvåfärgad identifierings potential? Krävs det en sekundär etikett, och kan etiketten enkelt tas bort för journalföring ändamål (dvs. patienten kontroll) efter uppvärmningen? 2) Teknisk lätthet -Kan embryon lätt laddas in / på enheten i tid och enkelt identifieras och spåras efter uppvärmningen? 3) procedur enkelhet / Repeterbarhet -Har vitrifikationsmetoden erbjuda enkelhet och pålitlighet som lätt medger repeterbarhet, vilket minimerar variationen mellan tekniker (interna) och program (extern)? 4) LN två lagringskapacitet -Kan enheterna lätt och säkert hanteras och identifieras? Är deras storasa potentiellt utrymme effektiv? Har enheten erbjuda trygghet och säkerhet från fysiska skador eller eventuella föroreningar som ett aseptiskt slutet system? 5) Återhämtning potential / överlevnads -Är enheten designen benägna att potentiella problem i den garanterade återvinning av embryon, och de kommer att på ett tillförlitligt sätt förglasas och upprätthålla fullständig cellulär integritet efter uppvärmningen? Den senare viss kvalitet oro, återvinningsgraden, har faktiskt överraskande minimeras publicerade rapporter; Detta görs genom att i allmänhet döljer det negativa resultatet (dvs förlorade embryo eller ägg) i typiskt-bra överlevnad. Varje enhet benägna att inkonsekvent återhämtning (<99%) är allvarliga brister och utgör en procedur ansvar.
Vår aseptiska slutna iS-VTF metod har strategiskt utvecklat för att redogöra för varje kvalitetskontrollåtgärd. Men efter 5 års överlägsen klinisk framgång och validering 14 förfarandet hade to ändras. De ursprungliga 0,3-ml embryo sugrör (som har en hydrofob plugg) avlägsnades från IVF industrin och ersattes med en 0,3-ml sperma halm som har en vanlig bomull / PVP plugg (dvs relabeled som sperma / embryon halm). Detta förfarande papper beskriver de specifika åtgärder och strategier som behövs för att genomföra iS-VTF säkert, enkelt och effektivt. Dessutom lyfter vi modifiering (ar) som krävs för att på ett tillförlitligt sätt redogöra för begränsningar försörjnings tills en alternativ ideal halm behållare återinförs tillbaka i det kliniska laboratoriet.
Idag finns det en hög förväntan att uppnå fullständig blastocysten överlevnad (> 95%) och att uppnå implantation framgång som liknar den färska embryon. Vissa grupper har föreslagit att de levande födelsetalen av keramiskt embryoöverföring cykler är kanske ännu högre än färska blastocyster när den intakta frysförvarade embryot transplanteras in i en frisk, icke-hormonellt stimulerade livmoder. Våra data visar tydligt att förglasning effektivt och tillförlitligt upprätthåller livskraft färska embryon. Dessutom har vi visat att vår aseptiska, sluten metod, som kallas MicroSecure Förglasning (iS-VTF), kan uppnå optimala resultat är jämförbar med eller högre än de kommersiella standarder (dvs öppna enhetssystem) som används i IVF industrin.
Variation är förknippad med teknisk repeterbarhet och tillförlitlighet mellan personer som använder en mängd förglasning enheter / metoder. I sin tur har detta resulterat i inconsistencies mellan program tillämpar förglasning. Därför är det inte förvånande att enheten förtrogenhet är en viktig faktor när det gäller laboratoriekompetens och goda resultat. Det är detta koncept med "teknisk signatur" 11 som förklarar varför repeterbarhet mellan program kan vara problematiskt. Inte bara har utvecklingen av mer än ett dussin kommersiella enheter komplicerat detta fenomen, har det skapat kvalitetskontroll oro. Lyckligtvis stängd förglasning system, som iS-VTF, Rapid-I, och VitriSafe, nu visat sig vara lika effektiv för att öppna enhetssystem 12, 13, 14.
MicroSecure VTF är en roman, aseptisk förglasning teknik som utvecklats med tekniska lätthet, tillförlitlighet och kryo-säkerhet i åtanke. Genom att kombinera användningen av två tidigare godkända, FDA kompatibla enheter, är det en icke-kommersiell vitrifiering systemet wed den klara fördelen av att ha en etablerad låg kostnad, i motsats till specialiserade enheter. Dessutom har dess unika manipulerings och intern systemet tvåfärgad märkning, liksom många andra kvalitetskontroll fördelar gjort iS-VTF en attraktiv global alternativ 11. Som en icke-kommersiell VTF anordning är emellertid dess utbredda industriell tillämpning utvecklas långsamt. Endast genom fortsatt publicering av dess säkerhet, säkerhet och klinisk effektivitet kommer iS-VTF vinst växande utnyttjande.
I augusti 2014, när man står inför oförmågan att förvärva den ursprungliga 0,3 ml embryo halm tillverkas med en inre, icke transporterande hydrofoba kontakten, kunde vi på ett tillförlitligt sätt modifiera iS-VTF metoden. Kort sagt, var de nya 0,3-ml sperma / embryo strån med sina bomulls PVP pluggar effektivt anpassas. Detta var helt enkelt uppnås genom att skapa en inre tätning före bomullsplugg, vilket förhindrar kontakt och vätsketransporterande medöppen VTF spets (dvs flexipette innehåller embryot eller ägg). Dessutom, om 40 mm ID stavar inte är tillgängliga, flyt frågan i samband med de ljusare 30 mm stavar kan counterweighted med två kullager.
Dessa ytterligare steg har gjort tekniken något mindre enkel, men ändå mycket effektivt. Idag, ekonomi och effektivitet blir allt viktigare problem, som biopsier blastocyster vanligtvis förglasat individuellt tills deras euploidy status bekräftas på en genetik rapport. Blastocyster med en bekräftad icke livskraftiga aneuploidi status vanligtvis får kasseras med patientens medgivande, inom några veckor. Således är en majoritet (> 50%) av VTF enheter kasseras efter kort tids förvaring, vilket orsakar en eskalerande årlig kostnad vid användning av kommersiella enheter. Totalt sett är iS-VTF en mycket effektiv, pålitlig och repeterbar förfarande för kryokonservering av humana blastocyster. Den överlägsna kvalitetskontroll konstruktion securely etiketter och säkert lagrar embryon / ägg samtidigt som man eliminerar återhämtning fel och optimera efter uppvärmningen överlevnad och lönsamhet, vilket motiverar systemets användning som en universell metod för embryo förglasning.
The authors have nothing to disclose.
MC Schiewe vill tacka Mr Forest Garner vid Fertilitetscentrum i Las Vegas för hans statistisk expertis i att analysera och utvärdera årliga CDC och SART uppgifter. Även författarna vill tacka sin Medical Director, Dr Robert E. Anderson, för hans hängivna stöd och tro på vår tekniska kompetens och expertis.
Aluminum Cane | IVM | XC055 | ||||
Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel | |||
CBS semen/embryo straw, 0.3ml | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile | |||
Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted | |||
Culture tubes, 15ml | Falcon | 352099 | Conical | |||
Culture tubes, 10ml | Falcon | 352057 | Snap-cap | |||
Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | ||||
Filter, 250ml | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm | |||
Flasks, Tissue Culture 50ml | Falcon | 353014 | ||||
Flexipettes, 300μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack | |||
Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | ||||
Forcep,Splinter – fine | Miltex | 17-305 | ||||
Goblet | IVM | PA003 | ||||
Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110V or 220V with adapter | |||
Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100ml | with non-essential AA's | ||||
Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors | |||
Liquid Nitrogen Tank, 40L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage | |||
LN2 Dewar flask, 0.5L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel | |||
6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case | |||
Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex | |||
Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351006 | ||||
Petri Dishes, 58mm | Nunc | 150288 | ||||
Petri Dishes, 100mm | Falcon | 351029 | ||||
Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10-100μl | |||
Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable | |||
Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | ||||
Pipettes, Serological 1ml | Falcon | 357521 | ||||
Pipettes, Serological 2ml | Falcon | 357507 | ||||
Pipettes, Serological 5ml | Falcon | 357543 | ||||
Pipettes, Serological 10ml | Falcon | 357551 | ||||
Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | ||||
Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | ||||
Sterile Gauze pads, 4"x4" | Kendall Healthcare | 6939 | ||||
Synthetic serum | Life Global or | LGPS-20 ; 20ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10ml | purchase low endotoxin lot | ||||
Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50ml flasks, 1year | |||
17.1g/flask +Medium to 50ml | ||||||
makes a 1M solution | ||||||
Filter with 0.22µm unit | ||||||
Timer | Nalgene | 5016-001 | ||||
Thawing Solution | Innovative | BL-TS | T1, T2, T3, T4 | |||
Cryo Enterprises | (≤1.0M Sucrose) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
Vitrification Solution*,** | Innovative | BL-VS | V1, V2, V3 | |||
Cryo Enterprises | (≥7.9M [Glycerol/EG]) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | ||||||
** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. |