Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.
Regenerativ medicin har til formål at konstruere materialer til at erstatte eller genoprette beskadigede eller syge organer. De mekaniske egenskaber af sådanne materialer bør efterligner humane væv, de søger at erstatte; at tilvejebringe den krævede anatomiske form, skal materialerne være i stand til at opretholde de mekaniske kræfter, som de vil opleve, når implanteret på defektstedet. Selvom de mekaniske egenskaber af væv-manipuleret scaffolds er af stor betydning, mange humane væv, der undergår restaurering med manipuleret materialer er ikke blevet fuldt biomekanisk karakteriseret. Adskillige tryk- og trækstyrke protokoller rapporteres til evaluering materialer, men med stor variation er det vanskeligt at sammenligne resultaterne mellem studier. Yderligere komplicerer undersøgelserne er ofte destruktive karakter af mekanisk test. Mens en forståelse af væv fiasko er vigtigt, er det også vigtigt at have kendskab til de elastiske og viskoelastiske egenskaber under mere Physiological belastningsforhold.
Denne rapport har til formål at give et minimalt destruktiv protokol til at evaluere de tryk- og trækstyrke egenskaber af humane bløde væv. Som eksempler på denne teknik, er den trækprøvning af huden og kompressionskraft test af brusk beskrevet. Disse protokoller kan også påføres direkte på syntetiske materialer for at sikre, at de mekaniske egenskaber ligner det native væv. Protokoller til at vurdere de mekaniske egenskaber af menneskelig indfødte væv vil give et benchmark, som at skabe egnede væv-manipuleret erstatninger.
Patienterne er i stigende grad venter på forskellige organtransplantationer til at behandle nødlidende eller tilskadekomne organer. Men med manglen på egnede donororganer, er regenerativ medicin til formål at skabe alternative løsninger til patienter med slutstadiet organsvigt. Regenerativ medicin har til formål at imødekomme denne kliniske behov ved konstruktionsmaterialer til at fungere som væv erstatninger, herunder bløde væv, såsom brusk og hud. At skabe en succesfuld materiale til at genoprette beskadigede væv, bør erstatningsmaterialet efterligne egenskaberne af det native væv det vil erstatte 1-2. Når kirurgisk implanteret, vil materialet skal give anatomiske form til vævsdefekten og således de mekaniske egenskaber af materialet er afgørende 1. For eksempel bør et materiale til erstatning auricular brusk har de passende mekaniske egenskaber til at forhindre kompression af den overliggende hud 2. Ligeledes til et materiale erstatte nasal biltilage skal have tilstrækkelige mekaniske egenskaber til at forebygge kollapse under vejrtrækning 3. Trods betydningen af mekaniske egenskaber ved fremstillingen af materialer til implantering, har få tegn fokuseret på karakterisering af de mekaniske egenskaber af forskellige humane væv.
Mekanisk testning regimer kan anvendes til at fastslå kompressionskraft, trækstyrke, bøjning, eller shear egenskaber af et væv. Hud er en meget anisotropisk, viskoelastiske, og næsten usammentrykkelige materiale 4-9. Almindeligt udskåret hud testes under anvendelse enaksede trækstyrke metoderne, hvor en hensigtsmæssigt formet strimmel af hud gribes i begge ender og strakt mens belastningen og forlængelsen registreres 4-9.
Eftersom hovedbestanddelen i alle bløde væv er interstitiel vand, den mekaniske reaktion af brusk er stærkt relateret til strømningen af fluid gennem vævet 10-11. Blødt væv, såsom brusk have traditionelt været testet ved anvendelse kompressionsprøvning. Metoderne til test i kompression er ganske varieret, med begrænset, unconfined, og indrykning er den mest udbredte (figur 1). Inden begrænset kompression, er en brusk prøve anbringes i en uigennemtrængelig, væskefyldte godt og indlæst gennem en porøs plade. Da brønden er ikke-porøs, flow selvom brusken er i den vertikale retning 12-13. I unconfined kompressionen bliver brusk indlæses ved hjælp af en ikke-porøs plade på et ikke-porøst kammer, tvinger væskestrømmen til at være overvejende radial 12-13. Indrykning er den hyppigst anvendte metode til evaluering af biomekaniske egenskaber af brusk 12-13. Den består af en indrykning, mindre end overfladen af prøven, der testes tilstand bringes ned på prøven. Fordybning har mange fordele frem for andre metoder til kompression, herunder det faktum, at fordybningen kan udføres in situ, enabling testen til at være mere fysiologisk (figur 1) 12-13.
For at forstå de tryk- og strækegenskaber et væv, er Youngs elasticitetsmodul typisk beregnet ved at analysere den lineære del af stress-strain kurve, som angiver den elastiske modstand mod kompression eller spænding, uanset prøvestørrelse 12. Både træk- og trykstyrke test regimer kan variere alt efter belastningen eller deformation påføres og hastigheden af begge sådanne parametre. På nuværende tidspunkt findes der mange forskellige testprotokoller til vurdering væv mekanik, hvilket gør det ekstremt vanskeligt at fortolke eller sammenligne resultaterne fra forskellige undersøgelser 6-13. Endvidere har mange mekaniske metoder øjeblikket fokuserer på karakterisere de mekaniske egenskaber af vævet ved at teste enheden til destruktion. Vi tilstræber at demonstrere en fordybning og træk- protokol, der giver direkte, ikke-destruktiv sammenligning af menneskeligblødt væv og væv-manipuleret konstruktioner.
Vi demonstrerer en metode, der begrænser de mekaniske prøvninger til stress og stadig opnår en Youngs elasticitetsmodul i kompression og spænding. Prøven stresset enten i træk eller tryk til en bestemt værdi, og når den valgte stress værdi er nået, er prøven lov til at slappe af, mens registreres alle data. Denne metode opfanger både de viskoelastiske og afslapning egenskaber af væv i den samme test, som kan anvendes direkte på det syntetiske materiale. Vi har brugt indrykningen protokol at evaluere humane bløde væv, herunder hud- og brusk 14-16. Brusk vurderes ved hjælp indrykning test og hud evalueres ved hjælp af spænding test 14-16. Forskere har til formål at konstruere materialer med lignende egenskaber til humane bløddele kunne overveje at gennemføre disse protokoller.
Adskillige trækstyrke og indrykning protokoller er blevet offentliggjort at karakterisere humane bløde væv. Vi har givet en anden metode, som sigter mod at være mere diagnostisk og ikke-destruktiv. Prøverne gennemgår mekanisk prøvning i denne protokol er begrænset af belastningen i stedet for ved forskydning, som transducere er mere følsomme over for belastning end til forskydning. Derfor kan reproduktioner af forsøget være mere præcis tværs væv og syntetiske materialer. Under anvendelse af denne teknik har vi vist en trækstyrke protokol for evaluering hudvæv og en fordybning protokol for analyse bruskvæv. Begge protokoller er let og enkel at gennemføre og kan betragtes til karakterisering af humane bløde væv og væv-manipuleret konstruktioner.
Et af de vigtige skridt i den metode til at opnå en stress-afslapning kurve egnet til analyse er at sikre, at prøven ikke glider under testen. Tilstrækkelig fiksering er required, men dette skal afvejes mod forårsage nogen stress på prøverne og sikre, at indtrykningsanordningen er vinkelret på overfladen for at forhindre enhver forskydningsbelastning. Det er afgørende, at sammensætningen samt størrelsen og formen af vævet er ens mellem prøverne. For brusk, er det afgørende at bruge en gentagelig dissektion protokol og prøve dimensioner. For hudprøver, er det vigtigt at fjerne alt det subkutane væv for at opnå en gentagelig prøve. Det er også vigtigt at sikre, at for alle prøver, de specimen er identiske, herunder hydratisering, stuetemperatur, og optøningsprocessen, hvis det er relevant.
Der er nogle begrænsninger for de protokoller, der præsenteres. Undersøgelser har antydet, at deformationsegenskaber af hud og brusk afhænger objektorientering 13. Hud blev anerkendt for at være anisotropisk så langt tilbage som det 19. århundrede, med Langer demonstrerer i 1861, at huden har naturlige linjeraf spænding, benævnt Langer linjerne 4. Således ved karakterisering hudprøver, er det vigtigt at orientere alle prøver parallelt eller vinkelret på Langer Lines at undgå at indføre en metode forspænding 4. Brusk viser også anisotrope egenskaber og indeholder Hultkrantz linjer, som svarer til Langer linjer, så brusken kan deformere forskelligt, alt efter i hvilken retning det er indlæst 12, 19. Således er det vigtigt at øge prøvens størrelse for at muliggøre afprøvning af brusk i forskellige retninger. Som biomekaniske egenskaber af væv også variere med alder og køn, bør undersøgelser udføres med en repræsentant patient kohorte at opretholde gyldighed til den kliniske indstilling. Desuden har nogle mekaniske protokoller går ind forkonditionering hvor vævet undergår cykliske belastning til at sikre, at vævet er i en stabil tilstand for efterfølgende mekanisk test 20. Men den nøjagtige mekanisme af prekonditionering er uklar, og det nøjagtige antal cyklusser nødvendige for at producere en ensartet og gentagelig respons varierer i forskellige undersøgelser 20. Forskeren bør overveje, om ikke at medtage konditionering efter at have evalueret årsagen til at udføre den specifikke biomekaniske test 20.
Skin er en kompleks, multi-lag materiale, opdelt i tre hovedkategorier lag: epidermis, dermis og hypodermis 4. De mekaniske egenskaber af hudvæv er for nylig blevet evalueret under anvendelse in vivo-vurderinger 4. Dog kan protokoller trækprøvning anvendes til at forstå huden biomekanik udskåret hud 4. Sådanne test kan give oplysninger til at modellere stress-strain relationer, da de randbetingelser kan defineres fire. Typisk in vitro-test regimer bruger høje belastninger at karakterisere materialet til fiasko, mens in vivo systemer bruglav belastning spænder 4. Ved sammenligning biomekaniske henblik udskåret hud under spænding, er der en stor variation mellem forskellige undersøgelser, der spænder fra 2.9-150 MPa 4. Store forskelle mellem fag forventes på grund af naturlig biologisk variation, men forskelle i protokol regimer kan også forværre disse naturlige biologiske forskelle. For eksempel vil forskelle i Belastningen mellem protokoller forårsage variation, som større Belastningen forårsage mindre tid for fluidet at strømme ud, hvilket resulterer i en højere stivhed. De forberedelse, excision, og håndtering protokoller i huden væv vil også medføre forskelle i de mekaniske egenskaber 4. Denne protokol demonstreret til test hud giver en alternativ metode til forskere til at karakterisere hud væv. Det giver et par fordele, herunder evnen til at identificere de elastiske og viskoelastiske egenskaber af hudvæv i en mekanisk test, der giver mulighed for en større forståelse af hudeni en kort tid. Endvidere kan den samme test anvendes på væv-manipuleret udskiftninger at fremstille konstruktioner med lignende biomekaniske egenskaber som nativt hud.
Indrykning test giver en attraktiv løsning i forhold til begrænset kompression test for forståelsen biomekanik brusk 21. Fordybning har evnen til at bevare den fysiologiske struktur af brusk og tilvejebringer således værdier, der efterligner dem af et klinisk miljø. Brug af indrykning, er det også muligt at teste brusk, mens den stadig er fastgjort til den underliggende knogle. Indrykning giver også mulighed for fysiologisk test af brusk in vivo. Når to brusk overflader nærmer sig hinanden, idet kanterne omkring kontaktområdet "bule" på grund af vand under kontaktområdet forskydes sideværts efter kompressionskraft deformation 17, 21. Brusk indrykning skal udføres med en iDIndtast med en mindre radius end brusk prøve at tillade tilsvarende udbuling. Størrelsen af indtrykningsanordningen bør også være mindst 8 gange prøvens størrelse for at sikre, at brusk reagerer, som om det var en del af ubestemt prøve 22. Ved anvendelse af en indrykning meget mindre end radius af prøven diameter eliminerer stede i prøven skabelse randeffekter. Desuden indrykning undgår mulige eksperimentelle fejl forårsaget ved at teste bruskskader beskadiget af prøveudtagning. Indrykning også involverer ikke dyb prøveforberedelse, såsom begrænset kompression, hvilket giver små, tynde stykker brusk, der skal testes 17, 21. Desuden den ikke-destruktive metode indrykning betyder, at det har en potentiel anvendelse i kliniske omgivelser som et diagnostisk redskab efter validering og verificering undersøgelser er blevet udført.
Der er væsentlige forudsætninger med indrykning, som brugeren skal sikre for appropriate resultater. En kritisk randbetingelse i fordybningen loading kræver konstant kontakt mellem indtrykningsanordningen og brusken overflade (dvs. at overfladen ikke deformeres væk fra indtrykningsanordningen) 23, 24. Indrykning loading omfatter også antages randbetingelse, at kontakten mellem brusk overflade og indtrykningsanordningen er ikke-destruktiv (dvs. at indtrykningsanordningen er i kontakt med overfladen, men ikke går gennem overfladen, brusk Overfladen skal ikke svigte under indrykning) 25-26. Undersøgelser har vist, at denne randbetingelse kan verificeres ved anvendelse af India-blæk, som vil farve beskadigede områder ved påføring på brusk flade 25, 26. En yderligere randbetingelse antager, at indtrykningsanordningen komprimerer brusk vinkelret på overfladen af prøven. Den vinkelrette orientering af kompression er en vigtig grænse condition fordi komprimere i en vinkel, især hvis hjælp periodisk belastning, kan forårsage skridning, som kan inducere klipning komponenter, og ændre den mekaniske belastning. kan sikres Denne betingelse gennem omhyggelig testudstyr oprettet.
Efter de opsummerede protokoller er blevet optimeret til det bløde væv af interesse, vil det være nyttigt for forskerne at undersøge dynamisk afprøvning af vævet af interesse. Passende cyklisk belastning af prøver skal efterligne normale fysiologiske grænser og adfærd, såsom at efterligne gå eller andre gentagne bevægelser 27. Sammenfattende denne rapport viser simple mekaniske test protokoller til at vurdere de menneskelige væv. Gennemførelsen af disse protokoller vil give vigtige oplysninger om de biomekaniske egenskaber af væv, så væv-manipuleret konstruktioner til bedre efterligne den native væv.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the funding from Medical Research Council and Action Medical Research, which provided MG with a clinical fellowship, GN 2339, to conduct this work.
Digitial Vernier Calipers | Machine Mart | 40218046 | Digitial vernier caliper is used to measure sample thickness. |
Water Bath | Cole Parmer | UY-12504-94 | StableTemp Digital Water Bath Flask Holder used to defrost tissues samples if they are frozen. |
Mach-1 Material Testing Machine | Biomomentum | V500c | Mechanical Testing Machine used to test the mechancial properties of the tissues. |
Scalpel Blade | VWR | 233-5335 | Scalpel blades using to cut and dissect the tissues. |
Forceps | VWR | 470007-554 | Forceps used to dissect the tissues. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.2 | Life Technologies | 20012019 | PBS is used to hydate the tissue samples |