플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

요약

이 논문은 투과형 전자 현미경으로 현탁 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 cryofixation 방법을 설명한다.

초록

투과 전자 현미경 (TEM)은 단백질을 지역화하고 매우 높은 해상도에서 거대 분자 복합체를 시각화하기 위해 세포 미세 구조 연구를위한 특별한 도구입니다. 그러나, 기본 상태로 최대한 가까이 얻을, 완벽한 샘플 보존이 필요합니다. 알데히드와 기존의 전자 현미경 (EM) 고정은, 예를 들어, 좋은 미세 보존을 제공하지 않습니다. 고정 제의 느린 침투 세포 조직 개편 및 다양한 세포 구성 요소의 손실을 유도한다. 따라서, 종래의 고정은 EM 구조 및 항원의 순간 안정성 및 보존을 허용하지 않는다. 세포 내 이벤트를 검사하기위한 최선의 선택은 그 나라의 상태로 세포를 유지 동결 대체 고정 방법 다음 cryofixation을 사용하는 것입니다. 고압 냉동 세포 미세 구조의 무결성을 보존 / 동결 대체, 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 expensi이 필요장비를했습니다. 여기서, 현탁 세포 배양을위한 동결 교체 다음에 사용하기 쉽고 저렴한 동결 고정 방법이 제공된다.

서론

샘플 준비는 전자 현미경 연구의 성공을 위해 중요하다. 종래 EM 고정은 투과형 전자 현미경 (TEM) ¹ 조직 또는 세포를 고정하기위한 주요 방법이다. 먼저, 알데히드 및 ​​산화 오스뮴 화학적 실온에서 재료를 고정하기 위해 사용된다. 그 후, 재료는 유기 용매 탈수 함침 한 에폭시 수지에 포함된다. 이 방법은 셀에 고정 제의 침투 속도에 의존한다. 따라서, 세포 내용물의 생성물 추출은 일반적으로 ^2가 관찰된다.

Cryofixation 명확 세포 구조 ^3의 보존을위한 더 나은 대안 그대로를 유지하고있다. 얇은 수지 부분의 TEM 이미지 ^(4)의 높은 품질은 cryofixation / 동결 대체 방법을 사용하여 얻을 수있다. 이 기술의 목적은 유리화 BI를 얻는 것입니다얼음 결정 형성 또는 세포의 미세 구조가 손상되지 않도록 충분히 작은 포함 된 얼음 결정이없는 론적 샘플. 고압 동결 (HPF) 또한 (PF)을 동결 런지라고 매우 빠른 cryofixation는 샘플 cryofix 두 가지 방법이다. HPF 순간적 셀 분자를 고정화 종래 EM 고정에 의한 피해를 방지한다.....

프로토콜

Formvar 그리드 필름 1. 준비

참고 : 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트, 안경)를 사용하여 흄 후드 클로로포름 조작을 수행합니다. 400 메쉬 전자 현미경 구리 그리드를 사용합니다. 다른 그리드 유형 (다른 메쉬 크기, 금과 니켈 그리드)으로 동결의 품질이 나쁘다.

1. 클로로포름 0.3 % formvar의 100 mL의 용액을 제조 하였다. 이 동요없이 하룻밤을 용해 할 수 있습니다.
2. 400 메쉬 전자 microscopycopper 그리드 (직경 3.05 mm) 유리 바이알 (높이 3cm 직경 2cm)을 함유하는 아세톤 (제곱 인치당 구멍 수)을 넣어. 손의 순환 이동에 유리 바이알을 교반한다. 플라스틱 전송 피펫으로 아세톤을 제거합니다. 용매를 5 분 동안 증발하도록 허용. 여과지 상에이를 부어 그리드 전송하고 5 분 동안 건조 할 수있다.
3. 미끄러운 / 반짝이까지 보풀이없는 천으로 닦아 76 X 26mm ² 유리 슬라이드 폴란드어.
4. 결정 화기 (직경 15cm, 높이 7cm 용량 1,200 ㎖)에 취하여 증류수 가장자리에 채운다. 먼지를 제거하기 위해 두 표면 위에 유리 막대를 통과시킴으로써 물 표면을 청소한다.
5. 두 손가락....

결과

이 문서에서, 미세 구조 (도 1 및도 2)와 immunolabeling (도 3)에 대한 연구에 사용하기 쉽고 저렴한 런지 냉동 방법은 제시된다. 우리는 동결 대체 절차와 온난화 절차 대신 전용 시스템을 사용하여 24 시간 미만 6 시간 걸리는 특수 장비이 필요하지 않다는 점을 보여줍니다.

PF / 동결 교체 방법 사카 cerevisiae를 (도 1a 및도 1d-H), 분열 pombe의 (도 1b와의 세포 구조의 개선.......

토론

TEM은 소기관, 세포 및 조직의 미세 구조의 관찰을위한 강력한 방법이다. Cryofixation / 동결 대체는 현재 모두 미세 구조 및 단백질 항원의 보존을위한 최선의 방법입니다. 화학 고정 제를 침투 및 미세 구조 ^(2)의 전체 구조 안정화되기 전에 재 배열을 가능하게함으로써 매우 천천히 작동한다. 반대로, cryofixation / 동결 대체 즉시 세포 구조 ^(4)를 안정화시킨다. 그러나 cryofixation / 동결 대체 기술함으로써 응용 프로그램의 자신의 범위를 제한하는 제약과 어려움의 수를 포함한다. 이 샘플 동결 유물, 기술, 비용, 장비의 실현에 관한 것이다. 고압 동결 / 동결 대체 기술은 셀룰러 상세 ^{(6)의 보존, (7)의} 높은 수준을 가능하게했다. 대조적으로, PF 이미 OBS에 사용얼음

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
그리드	전자 현미경 과학	T400-Cu
Formvar	전자 현미경 과학	15800
프로판 N35
액체 질소
양날 해부 바늘	전자 현미경 과학	72947
Cryovials	전자 현미경 과학	61802-02
오스뮴 테트록사이드	전자 현미경 과학	19130
유리 바이알 8.5mL	전자 현미경 과학	64252
우라닐 아세테이트	전자 현미경 과학	48851
아세톤	시그마	32201
에탄올 100%	시그마	32221
유리 슬라이드	VWR international	631-9439
핀셋
아크릴 수지	전자 현미경 과학	104371
에폭시 수지 M	Sigma	10951
에폭시 수지 M 경화제	Sigma	10953
디부틸 프탈레이트	Sigma	80102
에폭시 수지 M 가속 장치	Sigma	10952
결정화기	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
황동 컵			직접 쇼핑하거나 직접 만듭니다
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
밀폐 상자	Fischer scientific	7135-0001
공기 정화 호흡기	Fischer scientific	3M 7502
호흡기	Fischer scientific	3M 6001
미립자 필터	Fischer scientific	3M 5N11용 카트리지;

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