Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

Summary

Este manuscrito descreve um método fácil de usar e criofixação de baixo custo para a visualização de células em suspensão por meio de microscopia electrónica de transmissão.

Abstract

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) é uma ferramenta extraordinária para estudar a ultra-estrutura celular, a fim de localizar proteínas e visualizar complexos macromoleculares em resolução muito alta. No entanto, para chegar o mais perto possível do estado nativo, preservação amostra perfeita é necessária. fixação convencional microscopia electrónica (EM) com aldeídos, por exemplo, não proporcionar uma boa preservação ultraestrutural. A penetração lenta de fixadores induz reorganização de células e perda de vários componentes celulares. Portanto, a fixação EM convencional não permite para uma estabilização instantânea e preservação de estruturas e antigenicidade. A melhor escolha para examinar eventos intracelulares é usar criofixação seguido pelo método de fixação de congelamento e de substituição que mantém as células em seu estado nativo. congelamento de alta pressão / congelar-substituição, o qual preserva a integridade da ultra-estrutura celular, é o método mais vulgarmente utilizado, mas requer expensive equipamento. Aqui, um método fácil de usar e congelamento de fixação de baixo custo seguido de congelamento de substituição de culturas de células de suspensão é apresentado.

Introduction

A preparação da amostra é crítico para o sucesso de qualquer estudo de microscopia electrónica. EM convencional de fixação foi o principal método para a fixação de tecidos ou células por microscopia electrónica de transmissão (TEM) ^1. Em primeiro lugar, aldeídos e tetróxido de ósmio são usados ​​para fixar o material quimicamente à temperatura ambiente. Em seguida, o material é desidratado com solventes orgânicos, infiltrados e embebidos em resina epoxi. Este método é dependente da taxa de penetração de fixadores para dentro da célula. Por conseguinte, os artefactos e extracção de conteúdos celulares são geralmente observados ^dois.

Criofixação é claramente a melhor alternativa para a preservação de estruturas celulares ^3, mantendo-as intactas. A mais alta qualidade de imagens de TEM em ⁴ secções finas de resina pode ser obtida utilizando o método de substituição criofixação / congelamento. O objectivo desta técnica é a obtenção de bi vitrificadosamostras ological sem formação de cristais de gelo ou contendo cristais de gelo pequenos o suficiente para não danificar a ultra-estrutura das células. congelamento de alta pressão (HPF) e criofixação ultra-rápida, que também é chamado mergulho congelação (PF), são dois métodos para cryofix amostras. HPF imobiliza moléculas na célula instantaneamente e evita o dano causado por fixação EM convencional. Vários tipos de máquinas de congelamento e dispositivos de substituição automática foram desenvolvidos ^5. As máquinas de congelamento e de consumo (azoto líquido, espécime transportadoras, etc.) são caros, mas eles permitem a produção de micrografias electrónicas de alta qualidade ^{6, 7.} PF é uma técnica que foi usada no início dos anos 1950 e está descrito na literatura como simples e barato ⁸ .Durante o procedimento PF, a amostra preparada é congelado a uma taxa rápida para se obter cristais de gelo com tamanho inferior a 3 a 5 nm. Para este fim, a amostra émergulhado num líquido criogénico, tal como etano, propano, ou uma mistura de etano-propano. Desde 1950, as melhorias de PF ter sido feito para tornar esta técnica disponível para um número maior de usuários. Congelamento de alta pressão é actualmente o único meio viável para congelar uma grande variedade de amostras mais espessa do que 50? M (até uma espessura de 200 um para as amostras em forma de disco) ^5, enquanto que PF é amplamente utilizado para a imagem objectos pequenos (<100 nm ), tal como complexos macromoleculares em suspensão em um filme fino de gelo amorfo ^9. Amostras maiores, por exemplo células eucarióticas, pode ser criofixados por PF, mas requer suportes de amostra, tais como tubos de cobre capilar ou sistemas de sanduíche ^{8, 10, 11.}

Aqui, um rápido, fácil de usar e de baixo custo mergulhar tecnologia / congelamento de substituição de congelamento utilizável para várias culturas de células em suspensão é apresentada.

Protocol

1. Preparação de Formvar Grade Film NOTA: Executar manipulação clorofórmio sob uma coifa utilizando equipamento de protecção individual (luvas, bata de laboratório, copos). Use 400 mesh grelhas de cobre de microscopia electrónica. Com outros tipos de grade (outros tamanhos de malha, ouro e grades níquel), a qualidade do congelamento é pior. Prepara-se uma solução de 100 mL de 0,3% formvar em clorofórmio. Permita que ele se dissolver durante a noite sem agitação. </…

Representative Results

Neste artigo, um método de congelação fácil de usar e de imersão de baixo custo para ultra-estruturais (Figuras 1 e Figura 2) e estudos de imunomarcação (Figura 3) é apresentada. Nós demonstramos que não é necessário ter um equipamento especial para o processo de congelamento e de substituição e que o procedimento de aquecimento leva menos de 6 h, em vez das 24 h usando um sistema dedi…

Discussion

TEM é um método poderoso para a observação ultraestrutural de organelos, células e tecidos. Criofixação / congelamento-substituição é actualmente o melhor método para a preservação de ambos ultraestrutura e proteína antigenicidade. Fixadores químicos penetrar e actuar, desse modo permitindo que muito lentamente rearranjos estruturais antes da estabilização completa da ultra-estrutura ^2. Por outro lado, a criofixação / congelamento-substituição estabiliza instantaneamente estr…

Materials

Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8,5 ml	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia Coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11