מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
תחמוצת החנקן (NO) הוא אחד מולקולות הרגולטור הראשי הומאוסטזיס וסקולרית וגם מוליך עצבי. NO מיוצר enzymatically מתחמצן לתוך הניטריט ו חנקתי על ידי אינטראקציות עם חלבונים אצטילן-heme שונים ועדיין אחרים לא מסלולים ידועים. התהליך ההפוך, הפחתה של הניטריט ו חנקתי לתוך NO התגלה ביונקים בעשור האחרון והוא צובר תשומת לב כאחד המסלולים ניתן גם למנוע או להקל על מגוון שלם של לב, חילוף חומרים והפרעות שרירים כי הם חשבו להיות מזוהה עם רמות של NO ירד. לכן חשוב לאמוד את הסכום של NO מטבוליטים שלו בתאים שונים בגוף – דם, נוזלי גוף ואת הרקמות השונות. דם, בשל נגישותו הקלה, הוא התא העדיף המשמש להערכת NO מטבוליטים. בשל החיים הקצרים שלה (כמה אלפיות) וריכוז תת-nanomolar נמוך, מדידות אמינות ישירות של דם NO <em> In vivo נוכחי קשיים טכניים נהדרים. לפיכך אין הזמין בדרך כלל מוערך על בסיס הסכום של מוצרי חמצון שלה, הניטריט ו חנק. מטבוליטים אלה שני תמיד נמדדים בנפרד. ישנן מספר שיטות מבוססות היטב כדי לקבוע הריכוזים שלהם נוזלים ביולוגיים ורקמות. כאן אנו מציגים פרוטוקול השיטה chemiluminescence (CL), מבוסס על זיהוי spectrophotometrical של NO לאחר הפחתת ניטריט או ניטראט ידי יודיד תלת או ונדיום (III) פתרונות כלוריד, בהתאמה. רגישות ניטריט וזיהוי חנק נמצאת בטווח nanomolar נמוך, ומגדירת CL כשיטה הרגישה ביותר הקיימים כיום כדי לקבוע שינויי NO מסלולים מטבוליים. אנחנו מסבירים בפירוט כיצד להכין דגימות נוזלים ביולוגיים ורקמות כדי לשמר סכומים מקוריים של ניטריט ובהווה חנק בעת האיסוף כיצד לקבוע את גובה הסכומים שלהם בדגימות. מגבלות הטכניקה CL הם גם explained.
Introduction
ניטריט, וכדי חנק להאריך פחות, רמות בדם משקפים מצב כללי של גוף NO מטבוליזם. ריכוזי ניטריט בדם ורוב האיברים והרקמות הם רק nanomolar גבוהה או טווח מיקרו נמוכה, חנקתי הוא בדרך כלל נוכח כמויות גבוהות בהרבה – בטווח מיקרו. שינויים ברמות ניטריט בשל התקדמות המחלה או שינויים בהרגלי התזונה הם די קטנים וניתן למדוד רק באמצעות שיטה רגישה מאוד. בגלל הרמות מאוד שונות התהליכים מטבוליים שונים שלהם, נחישות נפרדת של רמות ניטריט ניטרט היא חיונית. מה שנקרא "אין בקביעה x" איפה ניטריט ניטרט נמדדים ביחד יש ערך מועט מאוד.
מספר שיטות לכימות ניטריט ב דגימות ביולוגיות שונות פותחו – הנפוצה ביותר להיות בכור אחד, המבוסס על תגובת Griess אשר תוארה לראשונה בשנת 1879. אפילו עם modificatio המודרניתNS, המגבלה הרגישה ניטריט השגה בשיטה 'Griess נמצאת בטווח מייקרו נמוך. Chemiluminescence (CL), בשילוב עם פתרון להפחתת יודיד תלת, נחשב כיום השיטה הרגישה ביותר, המאפשר כימות בטווח nanomolar נמוכה של ריכוזי ניטריט 1-8,10,11. השיטה הזהה CL, בשילוב עם ונדיום (III) כלוריד צמצום פתרון, יכולה לשמש למדידות רגישות של חנק, עם דיוק בטווח nanomolar 9.
CL מזהה NO דלק חינם. לכן, ניטריט, ניטראט, R-nitrosothiols (R-Sno), R-nitrosoamines (R-Nno), או תרכובות מתכת-NO (בהמשך כתב היד המכונה בשם "R- (X) -NO"), חייב להיות מומר לשחרר אין גז על מנת לכמת הסכומים המקוריים שלהם באמצעות CL. המרה ל NO מושגת באמצעות מספר פתרונות לצמצום שונים, בהתאם לאופי של NO המטבוליט. לאחר המרה, גז NO חינם נמחק כליל כלי התגובה ידי גז מוביל (הוא, N2 או Ar) לתוך תא התגובה של מנתח CL שבו אוזון (O 3) בשילוב עם NO ליצירת תחמוצת החנקן (NO 2) במצב מופעל שלה. עם החזרה למצב הקרקע, NO 2 * פולט באזור אינפרא אדום פוטון שנפלט הוא זוהה על ידי מכפיל (PMT) של מכשיר CL. עוצמת האור הנפלט היא ביחס ישר ל NO ריכוז בתא תגובה, המאפשר חישוב של הריכוז של המינים המקוריים באמצעות עקומות כיול ראויות.
בפרוטוקול שלנו, אנו נחישות CL המבוסס הנוכחית הראשון של הניטריט ו חנק בהגדרות הקליניות הנפוצות ביותר – בדם ופלזמה, ולאחר מכן אנו דנים כיצד לקבוע יונים אלה בדגימות רקמה. אנו גם להסביר בפירוט כיצד לשמר את ריכוז ניטריט הפיזיולוגי המקורי בסביבות ניטריט-reactive, כגון דם והתאים שלה, פלזמה ותא דם אדום.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
Aliquots של כל הפתרונים (כולל המים) המשמשים להכנה, לדלל או אחרת לטיפול דגימות מקוריות צריך להישמר ובדק עבור ניטריט האפשרי או (לעתים קרובות יותר) זיהום חנק. גילינו כי רוב זיהום מקורם במים רבים כימיקלים המשמש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחברים רוצים להכיר תרומות קריטיות של ד"ר א 'Dejam ו MM פלטייה בפיתוח שימוש פתרון לשימור ניטריט למדידות ניטריט בדם.
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
References
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
- Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E., Hancock, J. T. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. 476, 11-28 (2008).
- Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
- Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
- Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
- Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
- Smárason, A. K. 1., Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).
- Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
- Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
