المناعية الأقسام مملوءة Biocytin والمجهزة لالكيميائية العصبية علامات
Summary
ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لاسترداد المورفولوجية من الخلايا العصبية مصححة خلال التسجيلات الكهربية باستخدام ملء biocytin وتحليل نتائج المناعى لاحق. وتبين لنا أن أقسام مليئة biocytin السميكة التي كانت ملطخة وcoverslipped يمكن restained مع الثانية أيام الأجسام المضادة الأولية أو أشهر في وقت لاحق.
Abstract
سمحت التسجيلات الكهربية للخلايا باستخدام تقنية المشبك التصحيح لتحديد أنواع الخلايا العصبية المختلفة استنادا إلى أنماط اطلاق النار. إدراج biocytin / neurobiotin في القطب تسجيل يسمح الانتعاش خاصة بعد من التفاصيل الشكلية، والتي هي ضرورية لتحديد تشجر شجيري والمناطق المستهدفة من قبل محاور الخلايا العصبية المسجلة. ومع ذلك، ونظرا لوجود الخلايا العصبية مشابهة شكليا مع الهويات وظائف الكيميائية العصبية واضحة، وتلطيخ المناعى للبروتينات الخلية من نوع معين ضروري لتحديد نهائيا الخلايا العصبية. للحفاظ على الاتصال بالشبكة، يتم إعداد أقسام الدماغ للتسجيلات فسيولوجية في سمك 300 ميكرون أو أكبر. ومع ذلك، هذا السمك غالبا ما يعوق تحليل نتائج immunohistological بسبب القضايا مع اختراق الأجسام المضادة، مما استلزم resectioning من الأنسجة. Resectioning من شرائح هي فن تحديا، وغالبا ما بالنتيجهتينغ في فقدان الأنسجة والتشكل من الخلايا التي تم الحصول على بيانات الكهربية، مما يجعل البيانات غير صالحة للاستعمال. منذ استعادة التشكل من شأنه أن يحد فقدان البيانات ودليل في اختيار من علامات العصبية، فقد اعتمدنا استراتيجية لاستعادة شكل الخلية الأولى، تليها المناعية الثانوية. ونحن نقدم نهج عملي لbiocytin ملء خلال التسجيلات الفسيولوجية والمناعية التسلسلي لاحق لاسترداد التشكل، تليها restaining الفروع لتحديد هوية الكيميائية العصبية. نفيدكم أن المقاطع التي كانت مليئة biocytin ثابتة مع بارافورمالدهيد (PFA)، الملون، وcoverslipped يمكن إزالة وrestained مع الثانية أيام الأجسام المضادة الأولية في وقت لاحق. وتنطوي هذه restaining إزالة ساترة، وغسل المقاطع في حل العازلة، واحتضان الأجسام المضادة الأولية والثانوية للكشف عن هوية الكيميائية العصبية. هذه الطريقة مفيدة للقضاء على داتخسارة بسبب عدم القدرة على استعادة التشكل ولتضييق علامات الكيميائية العصبية التي سيتم اختبارها على أساس التشكل.
Introduction
ومن المعروف أن الدماغ التنوع في الخصائص الهيكلية والوظيفية من عناصر الخلايا العصبية الفردية لها. فهم الأدوار من أنواع الخلايا العصبية واضحة في وظيفة الدماغ وعلم الأمراض يتطلب توصيف وتحديد واضح للالخلايا العصبية. هيكليا، وملامح شكلية محددة حسب الموقع somato-شجيري تحدد المدخلات المحتملة التي تتلقى الخلايا العصبية معينة، في حين أن نمط تشجر محور عصبي ويحدد الأهداف بعد المشبكي المحتملة. كما تم تقدير التنوع الهيكلي من الخلايا العصبية منذ أيام الدراسات النسيجية المنوية رامون كاجال ذ ل 1. وكشف ظهور تقنيات التسجيل وحيدة الخلية أن الخلايا العصبية متميزة هيكليا تظهر أيضا اختلافات في أنماط اطلاق النار وخصائص متشابك. التنوع في هيكل وعلم وظائف الأعضاء واضح بشكل خاص في GABAergic الخلايا العصبية المثبطة 2،3. وبالإضافة إلى ذلك، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن structurallيمكن أن الخلايا العصبية مماثلة ص التعبير عن علامات الكيميائية العصبية المختلفة وعرض المقابلة الاختلافات 4 الوظيفية. وبالمثل، يمكن أن الخلايا العصبية مع نفس علامات العصبية الكيميائية لديها هياكل ووظائف 5-10 متميزة. وهكذا، في الممارسة العملية، وتحليل الخصائص الوظيفية للخلايا العصبية ودورها في شبكة يستلزم تحديد كل من الهويات المورفولوجية والكيميائية العصبية. حتى مع ظهور خطوط الماوس مراسل تستهدف علامات الكيميائية العصبية محددة، غالبا ما يكون من الضروري تحديد التشكل والهوية النوع الفرعي على أساس immunohistology 11.
الطريقة القياسية المستخدمة في وصف الخلايا المسجلة في شرائح الدماغ الحادة هو لملء هذه الشواغر مع biocytin أو neurobiotin أثناء التسجيل، وتحديد المقاطع في امتصاص العرق (PFA) بعد التسجيلات، واستخدام المناعية للكشف عن التشكل والكيمياء العصبية. منذ سمك أقسام لعلم وظائف الأعضاء شريحة وعادة ما تكون 300 ميكرونأو أكثر، وذلك لأن معظم الأجسام المضادة تفشل في اختراق على طول الطريق من خلال هذا العمق، تحتاج إلى شرائح لإعادة مقطوع إلى 60 ميكرون أو أقل للسماح المناعية وقت واحد لbiocytin وعلامات الكيميائية العصبية 12-14. للأسف، resectioning هي شاقة. مخاطر فقدان الأنسجة أثناء باجتزاء. ويمكن أن يؤدي إلى التفاضلية انكماش الأنسجة، وتعقيد عمليات إعادة البناء الصرفي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن معرفة مسبقة التشكل تساعد تضييق علامات المرشح التي من المحتمل أن يتم التعبير عنها من قبل الخلايا. لقد قمنا بتعديل البروتوكولات immunohistology biocytin القياسية للسماح معالجة التسلسلي أقسام أولا لاسترداد التشكل ومن ثم لتحديد علامات الكيميائية العصبية المحتملة.
المناعية هو دراسة توزيع مستضد في الأنسجة أو الخلايا ويمكن تصور باستخدام انزيم، والعلامات الفلورية، والعناصر المشعة، أو جزيئات الذهب الغروي 15. ط الداخليnvolves باستخدام الأجسام المضادة الأولية لوضع علامة على وجه التحديد وتضخيم واحد أو أكثر تحديدا مولدات المضادات، تليها استخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورية استهداف الأجسام المضادة الأولية التصور. نظرا للحاجة للتمييز بين أطياف مضان من كل الأجسام المضادة الثانوية دون تداخل، يمكن فحص سوى عدد محدود من مولدات المضادات في وقت واحد. وهكذا، يمكن معرفة مسبقة التشكل يكون مفيدا في اختيار العلامات الكيميائية العصبية مرشح لتصنيف الخلايا. من الناحية النظرية، ويستند الأساس المنطقي وراء معالجة التسلسلي أقسام ملطخة بالفعل على فرضية أن immunolabeling للبروتين واحد أو الببتيد لا ينبغي أن تتداخل مع استضداد وimmunolabeling لاحق لالببتيد مستقلة هيكليا 16. وهذا الافتقار إلى التدخل من المقرر أن الربط من الأجسام المضادة لبروتين حاتمة محددة على مستضد ويسمح لتلطيخ المتزامن لمستضدات متعددة في نفس النسيج بالتالي. عدد مستضدات revealeد كتبها المناعية محدودة بسبب الحاجة إلى أطياف غير متداخلة من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية والحاجة لاستهداف مستضدات الفردية مع الأجسام المضادة التي أثيرت في الأنواع المختلفة وذلك للقضاء عبر التفاعل 17،18. في حين أن هذا هو السبب وراء وضع العلامات المسلسل بدلا من المتزامن مع اثنين من الأجسام المضادة المميزة التي قد تتفاعل، على حد علمنا، المناعية للمستضد الثانية التي لم يتم الإبلاغ عنها بعد الانتهاء من immunolabeling للمستضدات واحد أو أكثر من الفروع التي شنت. هنا، نحن تصف طريقة لالمناعية التسلسلي أقسام الملون سابقا والتي شنت. في حين أننا التفاصيل هذه العملية لإجراء immunolabeling التسلسلي لاسترداد مورفولوجيا تليها تلطيخ لعلامات بروتين / الببتيد في أبواب سميكة، ونفس الإجراءات التي يمكن استخدامها في مستوى والأقسام النسيجية رقيقة أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف نهجا عمليا لملء الخلايا العصبية المسجلة مع biocytin وعملية لإزاحةالقطب من الخلية عند الانتهاء من التسجيلات لتحسين ملء محور عصبي والعرش الجذعية من الخلايا العصبية، كما وردت في منطقتنا 6،8 العمل مؤخرا.
الميزة الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو موضح هنا هي أن مورفولوجية الخلية سجلت يمكن استردادها بالكامل وتصوير قبل محاولة استئصال أو immunostain شرائح. على الرغم من القضايا مع تغلغل بعض الأجسام المضادة قد تجعل من الضروري شرائح استئصال لالمناعية الثانوية، فإن الإجراءات المفصلة هنا تلغي الحاجة إلى إعادة بناء الخلايا العصبية المعقدة من مقاطع متعددة، وسوف تتجنب القضايا بسبب فقدان الأنسجة وتقلص الفارق الذي يمكن أن تمس إعادة الإعمار بعد resectioning. ميزة إضافية هي أن هذه العملية سوف تقلل التكلفة والوقت والجهد، والأجسام المضادة مكلفة عن طريق الحد من المناعية وإعادة باجتزاء إلى شرائح التي يتم استرداد الخلايا العصبية مليئة biocytin. الجانب الأكثر عملية هو الإعلانالمناعية المشروط التي يمكن القيام بها على أقسام ملطخة أشهر قبل استخدام هذه التقنية المذكورة آنفا. على وجه الخصوص، فإن التعافي من مورفولوجيا تقلل إلى حد كبير من إمكانية أن البيانات الفسيولوجية من الخلايا يتم تجاهل نظرا لعدم القدرة على الحصول على التوصيف المورفولوجي الأساسية من نوع من الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
ملء الخلية مصححة مع biocytin هي الخطوة الأكثر أهمية لضمان الشفاء التام من التشكل. لتحقيق الانتعاش الكامل للخلية، لا بد من تحديد اتجاه شريحة الأمثل للحد من فك عمليات تشريح خلال. هذا التوجه قد تختل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NINDS R01 NS069861 وNJCBIR CBIR14IRG024 لاحقا!
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -. B., Yang, P. -. C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. . Concepts in Viral Pathogenesis II. , 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. . Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , (2007).
- Molnar, P. . Patch-clamp methods and protocols. 403, (2007).
- Martina, M., Taverna, S. . Patch-clamp methods and protocols. , (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny ‘fast-spiking’ cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
