Immunocoloration des articles biocytine remplis et transformés pour neurochimiques Marqueurs
Summary
Ce protocole présente un procédé pour la récupération morphologique des neurones corrigés lors des enregistrements électrophysiologiques en utilisant le remplissage de la biocytine et de post-traitement immunohistochimique ultérieure. Nous montrons que les sections de biocytin rempli d'épaisseur qui ont été colorées et sous une lamelle peuvent être recolorées avec un deuxième jours ou des mois d'anticorps primaires plus tard.
Abstract
Enregistrements électrophysiologiques des cellules en utilisant la technique du patch clamp ont permis l'identification de différents types de neurones en fonction des modèles de tir. L'inclusion de biocytin / neurobiotin dans l'électrode d'enregistrement permet la récupération post-hoc des détails morphologiques, qui sont nécessaires pour déterminer l'arborisation dendritique et les régions ciblées par les axones des neurones enregistrés. Toutefois, étant donné la présence de neurones morphologiquement similaires avec des identités et des fonctions neurochimiques distinctes, la coloration immunohistochimique pour les protéines cellule de type spécifique est essentiel d'identifier définitivement les neurones. Pour maintenir la connectivité de réseau, des sections de cerveau pour les enregistrements physiologiques sont préparées à une épaisseur de 300 um ou plus. Toutefois, cette épaisseur empêche souvent le post-traitement immunohistochimique à cause de problèmes avec la pénétration de l'anticorps, ce qui nécessite la résection du tissu. Résection de tranches est un art difficile, Resul souventtion de la perte de tissu et de la morphologie des cellules à partir desquelles les données électrophysiologiques ont été obtenus, ce qui rend les données inutilisable. Etant donné que la récupération de la morphologie limiterait la perte de données et le guide dans le choix des marqueurs neuronaux, nous avons adopté une stratégie de récupération de la morphologie des cellules en premier, suivi par immunocoloration secondaire. Nous introduisons une approche pratique pour biocytin remplissage pendant les enregistrements physiologiques et immunocoloration série subséquente pour la récupération de la morphologie, suivie par la recoloration des sections pour déterminer l'identité neurochimique. Nous rapportons que les articles qui ont été remplis avec biocytin, fixés avec du paraformaldehyde (PFA), colorées, et sous une lamelle peuvent être enlevés et recolorées avec un deuxième jours d'anticorps primaires plus tard. Cette recoloration implique la suppression de la lamelle couvre-objet, le lavage des coupes dans une solution tampon et l'incubation des anticorps primaires et secondaires afin de révéler l'identité neurochimique. Le procédé est avantageux pour l'élimination datune perte due à l'incapacité de recouvrer la morphologie et pour réduire la liste des marqueurs neurochimiques à tester sur la base de la morphologie.
Introduction
Le cerveau est connue pour la diversité dans les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de ses éléments neuronaux individuels. Comprendre les rôles des types de neurones distincts dans le fonctionnement du cerveau et de la pathologie nécessite la caractérisation et l'identification sans ambiguïté des neurones. Structurellement, les caractéristiques morphologiques définies par emplacement somato-dendritique déterminent les entrées potentielles qu'un neurone donné reçoit, tandis que le modèle d'arborisation axonale identifie des cibles postsynaptiques potentiels. La diversité structurelle des neurones a été apprécié depuis les journées d'études histologiques séminales de Ramón y Cajal 1. L'avènement des techniques d'enregistrement monocellulaires ont révélé que les neurones structurellement distincts présentent également des différences dans les schémas de mise à feu et des caractéristiques synaptiques. La diversité dans la structure et la physiologie est particulièrement évidente dans GABAergiques neurones inhibiteurs 2,3. En outre, il est devenu de plus en plus évident que structurally neurones similaires peuvent exprimer différents marqueurs neurochimiques et montrent des différences fonctionnelles 4 correspondantes. De même, les neurones avec les mêmes marqueurs neurochimiques peuvent avoir des structures et des fonctions 5-10 distinctes. Ainsi, en pratique, l'analyse des caractéristiques fonctionnelles des neurones et leur rôle dans le réseau implique de définir les deux identités morphologiques et neurochimiques. Même avec l'arrivée des lignées de souris rapporteurs de ciblage de marqueurs neurochimiques spécifiques, il est souvent nécessaire de déterminer la morphologie et l' identité des sous – types sur la base de 11 immunohistologie.
La méthode standard utilisée pour caractériser les cellules enregistrées dans des tranches de cerveau aiguë est de les remplir avec biocytin ou neurobiotin lors de l'enregistrement, de fixer les sections de paraformaldehyde (PFA) après les enregistrements, et utiliser l'immunohistochimie pour révéler la morphologie et la neurochimie. Comme l'épaisseur des sections pour la tranche de la physiologie sont généralement 300 umou plus, et parce que la plupart des anticorps ne parviennent pas à pénétrer tout au long de cette profondeur, les tranches doivent être re-coupe de 60 um ou moins pour permettre immunocoloration simultanée biocytine et des marqueurs neurochimiques 12-14. Malheureusement, la résection est laborieuse; les risques de perte de tissu pendant la coupe; et peut conduire à une différence de retrait des tissus, ce qui complique les reconstitutions morphologiques. En outre, la connaissance préalable de la morphologie pourrait aider à réduire les marqueurs candidats qui sont susceptibles d'être exprimé par les cellules. Nous avons modifié les protocoles de immunohistologiques biocytin standards pour permettre le traitement de série de premières sections pour la récupération de la morphologie et ensuite pour l'identification de marqueurs neurochimiques potentiels.
L' immunohistochimie est l'étude de la distribution des antigènes dans des tissus ou cellules et peut être visualisé en utilisant une enzyme, des marqueurs fluorescents, les éléments radioactifs, ou des particules colloïdales d'or 15. La procédure impl quent l'utilisation d'anticorps primaires pour marquer spécifiquement et amplifier un ou plusieurs antigènes spécifiques, suivie par l'utilisation d'anticorps secondaires fluorescents de ciblage de l'anticorps primaire pour la visualisation. En raison de la nécessité de distinguer les spectres de fluorescence de chaque anticorps secondaire sans chevauchement, seul un nombre limité d'antigènes peut être examinée simultanément. Ainsi, la connaissance préalable de la morphologie pourrait être utile dans le choix des candidats marqueurs neurochimiques pour la classification des cellules. Conceptuellement, la raison d'un traitement en série des sections déjà colorées est basé sur la prémisse que immunomarquage pour une protéine ou un peptide ne doit pas interférer avec antigénicité et immunomarquage subséquente pour un peptide structurellement indépendante 16. Cette absence d'interférence est due à la liaison des anticorps à un épitope de la protéine spécifique d'un antigène et permet la coloration simultanée des antigènes multiples dans le même tissu par conséquent. Le nombre d'antigènes Revealed par immunocoloration est limitée par la nécessité pour les spectres de non-chevauchement des anticorps secondaires fluorescents et par la nécessité de cibler des antigènes individuels avec des anticorps dirigés dans différentes espèces de façon à éliminer la réactivité croisée 17,18. Bien que ce soit le raisonnement derrière l'étiquetage série plutôt que simultanée avec deux anticorps différents qui peuvent interagir, à notre connaissance, immunocoloration pour un second antigène n'a pas été signalée après l'achèvement de immunomarquage pour un ou plusieurs antigènes sur des tronçons montés. Ici, nous décrivons une méthode pour immunocoloration série de sections précédemment colorées et montées. Alors que nous détaillons ce processus pour une procédure de immunomarquage série pour la récupération de la morphologie suivie d'une coloration des marqueurs de protéine / peptide dans des sections épaisses, les mêmes procédures peuvent être utilisées dans la norme, des sections minces histologiques ainsi. En outre, nous décrivons une approche pratique pour remplir les neurones enregistrés avec biocytin et le processus pour déloger lal' électrode de la cellule lors de l' achèvement des enregistrements afin d' optimiser le remplissage du axonale et arborisation dendritique des neurones, tels que présentés dans notre récent travail de 6,8.
L'avantage le plus important de la procédure décrite ici est que la morphologie de la cellule enregistrée peut être entièrement récupérée et imagée avant de tenter de résection ou immunocoloration des tranches. Bien que des problèmes avec la pénétration de certains anticorps peuvent rendre nécessaire de tranches de résection pour immunocoloration secondaire, les procédures détaillées ici éliminerait la nécessité de reconstruire les neurones complexes à partir de plusieurs sections et éviterait les problèmes dus à la perte de tissus et de retrait différentiel, ce qui peut compromettre la reconstruction suivant la résection. Un avantage supplémentaire est que le processus permettra de réduire le coût, le temps, l'effort, et des anticorps coûteux en limitant immunocoloration et re-sectionnant à des tranches dans lequel les neurones biocytin remplis sont récupérés. L'aspect le plus pratique est l'annonceimmunocoloration tradi- qui peut être effectuée sur des coupes colorées mois avant d'utiliser la technique mentionnée ci-dessus. En particulier, la récupération de la morphologie réduirait considérablement le risque que les données physiologiques à partir des cellules sont rejetées en raison d'une incapacité à obtenir une caractérisation morphologique de base du type de cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques dans le Protocole
Remplir la cellule patché avec biocytin est l'étape la plus cruciale pour assurer la récupération complète de la morphologie. Pour la récupération complète de la cellule, il est essentiel de choisir une orientation de tranche optimale pour minimiser la rupture des processus pendant le tranchage. Cette orientation peut varier en fonction du circuit et de type de cellule en cours d'examen. Ensuite, il est essentiel de prévoi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le soutien du NIH / NINDS R01 NS069861 et NJCBIR CBIR14IRG024 à VS.
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
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