Immunostaining סעיפים Biocytin מלא ומעובד מרקרים הנוירוכימיים
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה ההתאוששות מורפולוגי של נוירונים תוקנו במהלך הקלטות אלקטרו באמצעות מילוי biocytin ו postprocessing immunohistochemical שלאחר מכן. אנו מראים כי חלקים עבים המלאה biocytin כי היו מוכתמות coverslipped ניתן restained עם ימים או חודשי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן.
Abstract
קלטות אלקטרו של תאים באמצעות טכניקת מהדק התיקון אפשרו לזיהוי סוגי נוירונים שונים המבוססים על דפוסי ירי. הכללת biocytin / Neurobiotin ב האלקטרודה ההקלטה מתירה פוסט הוק התאוששות של פרטים מורפולוגיים, אשר נחוצים כדי לקבוע את arborization הדנדריטים ואת באזורים אליהם מכוונים את האקסונים של הנוירונים המוקלטים. עם זאת, בהתחשב בנוכחות של נוירונים דומים מורפולוגית עם זהויות הנוירוכימיים ברורות ופונקציות, מכתים immunohistochemical עבור חלבוני תא מסוג ספציפי חיוני לזהות נוירונים באופן סופי. כדי לשמור על קישוריות רשת, חלקים במוח להקלטות פיסיולוגיות ערוכים בעובי של 300 מיקרומטר או גדולים יותר. עם זאת, עובי זה לעתים קרובות מעכבת postprocessing immunohistological עקב בעיות עם חדירה נוגדן, דבר המחייב את resectioning של הרקמה. Resectioning של פרוסות הוא אמנות מאתגרת, לעתים קרובות Resulטינג אובדן רקמות המורפולוגיה של התאים שמהם נתוני אלקטרו הושגו, עיבוד הנתונים שמישים. מאז ההתאוששות של מורפולוגיה תגביל אובדן נתונים ומדריך בבחירת סמנים עצביים, אימצנו אסטרטגיה של מחלים מורפולוגיה התא הראשון, ואחריו immunostaining משנית. אנחנו מציגים גישה מעשית biocytin המילוי במהלך הקלטה פיסיולוגיים immunostaining סדרה נוסף של ההתאוששות של מורפולוגיה, ואחריו restaining סעיפים כדי לקבוע את הזהות הנוירוכימיים. אנו מדווחים כי הקטעים היו מלאים biocytin, קבועים עם paraformaldehyde (PFA), מוכתמים, ו coverslipped ניתן להסיר restained עם ימי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן. restaining זה כולל הסרת coverslip, כביסה הפרקים, פתרון חיץ, ו הדגירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים כדי לחשוף את זהותו הנוירוכימיים. השיטה היא יתרון עבור ביטול datהפסד עקב חוסר יכולת לשחזר מורפולוגיה עבור בצמצום סמנים הנוירוכימיים להיבדק המבוסס על מורפולוגיה.
Introduction
המוח ידוע גיוון המאפיינים המבניים ותפקודיים של האלמנטים העצביים הפרט שלה. הבנת התפקידים של סוגי נוירונים ברורים בתפקודי המוח והפתולוגיה דורש אפיון זיהוי חד משמעי של הנוירונים. מבחינה מבנית, תכונות המורפולוגיות המוגדרות לפי מיקום somato-הדנדריטים לקבוע את תשומות פוטנציאל שתא מוח נתון מקבל, בעוד הדפוס של arborization אקסונלית מזהה מטרות postsynaptic פוטנציאליות. המגוון המבני של נוירונים כבר מוערך מאז ימי המחקרים היסטולוגית הזרע של רמון y קחאל 1. הופעתו של טכניקות הקלטת תא בודד עולה כי נוירונים מבחינה מבנית גם להראות הבדלי דפוסי ירי ומאפיינים הסינפטי. המגוון במבנה ופיזיולוגיה בולט במיוחד נוירונים מעכבים GABAergic 2,3. בנוסף, היא הפכה יותר ויותר נראה כי structurallנוירונים דומה y יכול להביע סמנים הנוירוכימיים שונים ולהראות מקביל הבדלים פונקציונליים 4. בדומה לכך, נוירונים עם אותו הסמנים הנוירוכימיים יכולים להיות מבנים נפרדים ופונקציות 5-10. לכן, בפועל, הניתוח של המאפיינים הפונקציונליים של נוירונים ותפקידם הרשת כרוך להגדיר הן זהויות מורפולוגיים הנוירוכימיים. אפילו עם כניסתו של קווי עכבר כתב מיקוד סמנים הנוירוכימיים ספציפיים, זה לעתים קרובות יש צורך לקבוע מורפולוגיה וזהות תת סוג מבוסס על immunohistology 11.
השיטה הסטנדרטית המשמשת לאפיין תאים רשמו פרוסות מוח חריפות היא למלא אותם עם biocytin או Neurobiotin במהלך ההקלטה, לתקן את הסעיפים paraformaldehyde (PFA) בעקבות ההקלטות, ולהשתמש אימונוהיסטוכימיה כדי לחשוף את המורפולוגיה הנוירוכימיה. מאז עובי סעיפים עבור פיזיולוגיה פרוסה הם בדרך כלל 300 מיקרומטראו יותר, כי רוב הנוגדנים מצליחים לחדור לאורך כל הדרך בעומק זה, פרוסות צריך להיות מחדש מחולק ל -60 מיקרומטר או פחות כדי לאפשר immunostaining סימולטני biocytin וסמנים הנוירוכימיים 12-14. למרבה הצער, resectioning מייגע; סיכוני אובדן רקמות במהלך חתך; ויכול להוביל דיפרנציאלי הצטמקות רקמות, שמסבך שחזורים מורפולוגיים. בנוסף, ידע מוקדם של מורפולוגיה יכול לעזור לצמצם את הסמנים המועמדים כי צפוי לבוא לידי ביטוי על ידי התאים. יש לנו שונה פרוטוקולי immunohistology biocytin הסטנדרטיים כדי לאפשר עיבוד סדרה של החלקים ראשונים להתאוששות של מורפולוגיה ואז לזיהוי סמנים הנוירוכימיים פוטנציאליים.
אימונוהיסטוכימיה היא חקרה חלוקת אנטיגן ברקמות או תאים וניתן מדמיינת באמצעות אנזים, תוויות ניאון, יסודות רדיואקטיביים, או חלקיקי קולואיד זהב 15. אני ההליךnvolves באמצעות נוגדנים ראשוניים לתייג ולהגביר ספציפי אחד או יותר אנטיגנים במיוחד, ואחריו שימוש נוגדנים משני ניאון מיקוד הנוגדן הראשוני לשם ויזואליזציה. בשל הצורך להבחין בין ספקטרום הקרינה של כל נוגדנים משני ללא חפיפה, רק מספר מוגבל של אנטיגנים יכול להיבחן בו זמנית. לפיכך, ידע מוקדם של מורפולוגיה יכול להיות שימושי בבחירת סמנים הנוירוכימיים מועמד סיווג התא. מבחינה מושגית, את הרציונל מאחורי עיבוד סדר סעיפים כבר מוכתמים מבוסס על ההנחה כי immunolabeling עבור אחד חלבון או פפטיד אינו אמור להפריע antigenicity ו immunolabeling עוקבת עבור פפטיד עצמאית מבחינה מבנית 16. חוסר ההתערבות זאת בשל הכריכה של נוגדנים על epitope חלבון מסוים על אנטיגן ולכן מאפשר מכתים סימולטני של אנטיגנים מרובים באותו הרקמות. מספר אנטיגנים revealeד על ידי immunostaining הוא מוגבל על ידי צורך ספקטרה שאינה חופפת של נוגדנים משני פלורסנט, בצורך למקד אנטיגנים בודדים עם נוגדנים וגדלו מינים שונים כדי לחסל 17,18 תגובתיות צולבת. אמנם זהו ההיגיון מאחורי הסדרה ולא תיוג סימולטני עם שני נוגדנים ברורים שעשוי אינטראקציה, למיטב ידיעתנו, immunostaining עבור אנטיגן שני לא דווח לאחר השלים immunolabeling עבור אנטיגנים אחד או יותר על חלקים רכובים. כאן, אנו מתארים שיטה immunostaining סדר ויטראז'ים בעבר רכוב חלקים. בעוד אנו בפירוט את התהליך הזה עבור הליך immunolabeling סדר להחלמתם של מורפולוגיה ואחריו מכתים עבור סמנים חלבוניים / פפטיד חלקים עבים, אותם ההליכים ניתן להשתמש בתקן, סעיפים היסטולוגית דקים גם כן. בנוסף, אנו מתארים גישה מעשית למלא נוירונים מוקלטים עם biocytin והתהליך כדי לסלק אתאלקטרודה מהתא עם השלמת ההקלטות כדי לייעל את המילוי של axonal ו סוכות הדנדריטים של נוירונים, כמוצג 6,8 העבודה האחרונה שלנו.
היתרון החשוב ביותר של ההליך המתואר כאן הוא כי המורפולוגיה של התא רשם ניתן לשחזר באופן מלא צלמה לפני שתנסה כריתה או immunostain הפרוסות. למרות בעיות עם החדירה של נוגדנים מסוימים עשויות להבהיר את זה צורך פרוס כריתה עבור immunostaining המשנית, הנהלים המפורטים כאן היו מונעים את הצורך לשחזר נוירונים מורכבים ממקטעים מרובים היה למנוע בעיות עקב אובדן רקמות הצטמקות הפרש, אשר יכולים לסכן את שיקום בעקבות resectioning. יתרון נוסף הוא כי התהליך יהיה להפחית עלויות, זמן, מאמץ, ונוגדנים יקרים ידי הגבלת immunostaining מחדש חתך פרוס שבו מלאה biocytin נוירונים הם התאוששו. ההיבט המעשי ביותר הוא המודעותimmunostaining ditional שניתן לבצע על חודשים מוכתם סעיפים לפני השימוש בטכניקה הנ"ל. בפרט, ההתאוששות של מורפולוגיה תפחית את הפוטנציאל ניכר כי נתונים פיסיולוגיים מתאי נמחקת בשל חוסר יכולת להשיג אפיון מורפולוגי בסיסי של סוג התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
מילוי התא תוקן עם biocytin הוא הצעד החשוב ביותר כדי להבטיח את ההתאוששות המלאה של המורפולוגיה. מועד להחלמה מלאה של התא, זה הכרחי כדי לבחור את כיוון הדפסה פרוס אופטימלית כדי למזער את ניתוק התהליכי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות התמיכה מ- NIH / NINDS R01 NS069861 ו NJCBIR CBIR14IRG024 כדי VS.
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -. B., Yang, P. -. C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. . Concepts in Viral Pathogenesis II. , 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. . Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , (2007).
- Molnar, P. . Patch-clamp methods and protocols. 403, (2007).
- Martina, M., Taverna, S. . Patch-clamp methods and protocols. , (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny ‘fast-spiking’ cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
