Analyse de l'immunodéficience simienne CD8 spécifiques Virus<sup> +</sup> T-cellules dans rhésus macaques par Peptide-CMH-I tétramère Coloration
Summary
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour le dénombrement et la caractérisation des cellules macaques rhésus T CD8 + contre le virus du sida. Cet article est utile non seulement dans le domaine de l' immunologie du VIH, mais aussi à d' autres domaines de la recherche biomédicale où les réponses des lymphocytes T CD8 + sont connus pour affecter les résultats de la maladie.
Abstract
Peptide-majeur d' histocompatibilité de classe I (pMHC-I) tétramères ont été un outil précieux pour étudier CD8 + réponses des lymphocytes T. Du fait que ces réactifs se lient directement aux récepteurs des cellules T à la surface des lymphocytes T CD8 + des lymphocytes, des tétramères fluorochrome marqué pMHC-I permettent la détection précise de l' antigène (Ag) spécifique de cellules CD8 + des cellules T sans le besoin de re in vitro -stimulation. En outre, lorsqu'il est combiné avec multi-couleurs cytométrie en flux, pMHC-I coloration de tétramère peut révéler des aspects clés de cellules T Ag-spécifiques CD8 +, y compris l' étape de différenciation, phénotype mémoire, et l' état d'activation. Ces types d'analyses ont été particulièrement utiles dans le domaine de l' immunologie du VIH où les lymphocytes T CD8 + peuvent affecter la progression du sida. L'infection expérimentale de macaques rhésus avec le virus de l'immunodéficience simienne (SIV) fournit un outil précieux pour étudier l'immunité cellulaire contre le virus du sida. Par conséquent, PROGRE considérabless a été faite dans la définition et la caractérisation des réponses des lymphocytes T dans ce modèle animal. Nous présentons ici un protocole optimisé pour dénombrer les cellules T SIV spécifiques CD8 + dans macaques rhésus par pMHC-I coloration tétramère. Notre test permet la quantification et la mémoire simultanée phénotypage de deux populations pMHC-I tétramère + CD8 + T-cellules par test, qui pourraient être utiles pour le suivi des réponses des lymphocytes T CD8 + spécifique du SIV générés par la vaccination ou infection SIV. Compte tenu de l'importance des primates non humains dans la recherche biomédicale, cette méthode est applicable pour l' étude des réponses des CD8 + des cellules T dans de multiples contextes pathologiques.
Introduction
Les lymphocytes T CD8 + comprennent une composante essentielle du système immunitaire adaptatif car ils participent à la surveillance immunitaire de la tumeur et contribuent à l'élimination des agents pathogènes intracellulaires 1. En termes simples, les lymphocytes T CD8 + expriment des récepteurs de cellules T (TCR) qui reconnaissent spécifiquement le peptide majeur d' histocompatibilité de classe I (I) pMHC-molécules présentes sur la membrane plasmique des cellules hôtes. Étant donné que ces peptides sont dérivés de la protéolyse des protéines synthétisées de manière endogène, les complexes pMHC-I de surface cellulaire fournissent une fenêtre dans l'environnement intracellulaire. Lors de l' infection par le virus, par exemple, les cellules infectées présenteront des molécules du CMH-I , contenant des peptides dérivés de virus qui peuvent servir de ligands pour les TCR exprimés par les patrouilles des lymphocytes T CD8 +. Dans le cas d' une CD8 + des cellules T spécifiques du virus rencontre une cellule infectée présentant son ligand pMHC-I, l' engagement du TCR entraînera l' activation CD8 + et des lymphocytes T ultiron conduire à cibler la lyse cellulaire. Étant donné la nature critique de ces interactions TCR / pMHC-I, la détermination de l'ampleur, la spécificité et le phénotype de répondre lymphocytes T CD8 + peuvent souvent révéler des indices importants sur les maladies humaines.
Jusqu'au début des années 1990, la quantification des cellules T Ag spécifiques CD8 + appuyé sur la limitation de dosage de dilution exigeant techniquement (LDA) 2,3. Non seulement la LDA ne nécessite plusieurs jours pour être achevé, il a également échoué à détecter des cellules qui ne disposaient pas de potentiel prolifératif. Par conséquent, le LDA largement sous – estimer la fréquence réelle de l' antigène (Ag) , les cellules T CD8 + spécifique de participant à une réponse immunitaire. Bien que le développement de dosages ELISPOT et intracellulaire des cytokines de coloration a grandement amélioré la capacité à mesurer l' immunité cellulaire, ces procédés restent nécessaires stimulation in vitro pour la quantification des lymphocytes T spécifiques d' Ag-4. Ce ne fut pas avant 1996 que Altman, Davis et colleagues publié leur article historique des rapports du développement de la technologie de tétramère pMHC-I 5. Cruciale pour le succès de cette technique était la multimérisation des molécules pMHC-I, qui étendent la demi-vie des interactions TCR / pMHC-I, ce qui réduit la probabilité de tétramères pMHC I tombant au cours des étapes de lavage des tests de cytométrie de flux. Le principal avantage de tétramères pMHC-I au cours des essais mentionnés ci – dessus est la possibilité de détecter avec précision les cellules T spécifiques d' Ag CD8 + ex vivo directement sans la nécessité d' une stimulation in vitro nouveau dans. En outre, la combinaison de pMHC-I coloration tétramère avec multi-couleurs cytométrie en flux a permis des analyses détaillées du stade de différenciation, phénotype mémoire, et l' état d'activation de + cellules T CD8 Ag spécifiques 2-4. À la lumière des récents progrès techniques pour la caractérisation des répertoires CD8 + T-cell par pMHC-I multimère coloration 6, l'étendue des applications for cette méthodologie est susceptible de continuer à développer.
Peu de domaines de la recherche biomédicale ont plus bénéficié de pMHC-I coloration tétramère que le domaine de l' immunologie du VIH 7. Bien que les lymphocytes T CD8 + ont été temporellement associée au contrôle initial de la virémie VIH au moment de la publication par Altman, Davis et ses collègues 8,9, l'utilisation de tétramères pMHC-I dans les années qui ont suivi considérablement élargi notre compréhension de la réponse spécifique au VIH des cellules T CD8 +. Par exemple, pMHC-I coloration tétramère permis de confirmer la taille robuste de CD8 + réponses de cellules T spécifiques du virus dans la plupart des individus infectés par le VIH 10-12. Cette méthodologie a également facilité la caractérisation des VIH- et CD8 + réponses SIV spécifiques de lymphocytes T restreinte par les molécules du CMH-I associés au contrôle de la réplication virale spontanée en l'absence de thérapie antirétrovirale, un phénomène connu sous le nom "contrôle de l' élite" <sup> 13-15. En outre, les tétramères pMHC-I ont joué un rôle dans l' établissement de l'axe de la mort programmée 1 (PD-1) / PD ligand 1 (PD-L1) en tant que voie réversible pour le phénotype dysfonctionnel de CD8 spécifiques au VIH + des cellules T dans l' infection chronique incontrôlée 16,17. Collectivement, ces études soulignent l'utilité de tétramères pMHC-I pour la surveillance CD8 + réponses des lymphocytes T contre le virus du sida.
Infection SIV expérimentale de macaques rhésus (Macaca mulatta) reste le meilleur modèle animal pour évaluer les interventions immunitaires contre le VIH / SIDA 18,19. Au cours des 25 dernières années, des progrès substantiels ont été réalisés dans l'identification et la caractérisation des cellules T SIV-CD8 + spécifiques de cette espèce de singe, y compris la découverte d'allèles du CMH-I et la définition de liaison peptidiques motifs 13,20-27 . Par conséquent, les tétramères pMHC-I ont été mis au point pour l'analyse de SIV CD8 + spécifiques des lymphocytes Tles réponses dans ce modèle animal 28. La plupart de ces réactifs sont constitués des produits géniques de quatre macaques rhésus alleles du CMH-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, et Mamu-B * 017: 01. Fait à noter, les macaques rhésus n'expriment un locus MHC-C 29. La grande majorité des tétramères pMHC-I utilisés dans les présentes expériences ont été produites à l'installation NIH tétramère de base à l'Université Emory. Néanmoins, certains de ces réactifs, y compris Mamu-A1 * 001 tétramères liés à l'épitope immunodominant Gag CM9, ne peut être obtenu auprès de sources commerciales en raison d'accords de licence. Utilisation de tétramères pMHC-I des quatre allèles de macaques rhésus énumérés ci – dessus, nous avons énuméré avec succès des cellules T CD8 + contre un total de 21 épitopes SIV (tableau 1), qui ont été induites par la vaccination ou une infection SIV primaire 30,31 (Martins et al., observations non publiées).
Le présent manuscrit fournit uneoptimisé pMHC-I tétramère protocole de coloration pour déterminer la fréquence et de la mémoire phénotype des cellules T spécifiques du SIV CD8 + chez les macaques rhésus. L'essai commence par un stage de 30 minutes d' incubation avec un inhibiteur de la protéine kinase (PKI, ici, dasatinib est utilisé) afin de diminuer TCR intériorisation et ainsi améliorer pMHC-I tétramère coloration 32. Comme cela est décrit ci-après, ce traitement est particulièrement utile lors de l'utilisation Mamu-B * 017: 01 tétramères. Instructions sur la façon d'étiqueter les cellules avec tétramères pMHC-I fluorochrome conjugué et les anticorps monoclonaux (mAb) sont également fournis. Ce protocole comprend en outre une étape de perméabilisation cellulaire pour la détection intracellulaire de la molécule associée à la cytolyse granzyme B (MGZ B). Le mAb contre CD3 est ajouté à cette étape aussi bien pour améliorer la détection de cette molécule de signalisation TCR. À titre de référence, tous les fluorochromes utilisés dans ce panneau de coloration sont répertoriés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quelques étapes de cette procédure mérite discussion car ils sont essentiels pour produire des résultats optimaux. Premièrement, étant donné la qualité des échantillons biologiques est un puissant prédicteur de la réussite de toute cytométrie de flux dosage 38, tous les soins doivent être prises pour veiller à ce que les cellules sont viables et en suspension au cours de la procédure de coloration. Ceci est particulièrement vrai lorsque l'on travaille avec des échantillons cryoconservés …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier David Watkins pour soutenir les expériences qui ont permis l'optimisation de la méthodologie actuelle. La recherche rapportée dans la présente publication a été financée en partie par une subvention pilote fourni par le Centre de Miami for AIDS Research des National Institutes of Health sous le numéro d'attribution P30AI073961. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
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