サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析<sup> +</sup>ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞
Summary
ここでは、エイズウイルスに対するアカゲザルCD8 + T細胞を列挙し、特徴づけるための最適化されたプロトコルを提示します。この記事では、HIV免疫学の分野にだけでなく、CD8 + T細胞応答が疾患の転帰に影響を与えることが知られている生物医学研究の他の分野のみならず便利です。
Abstract
ペプチド-主要組織適合性複合体クラスI（のpMHC-I）四量体は、CD8 + T細胞応答を研究するための貴重なツールとなっています。これらの試薬は、直接CD8 + Tリンパ球の表面上のT細胞受容体に結合するので、蛍光色素標識のpMHC-I四量体は、抗原（Ag）からの正確な検出を可能にする特異的CD8 + T細胞のin vitro再を必要とせず-刺激。マルチカラーフローサイトメトリーと組み合わせた場合にさらに、のpMHC-I四量体染色は、分化段階、メモリー表現型および活性化状態を含む、Ag特異的CD8 + T細胞の重要な側面を明らかにすることができます。分析のこれらのタイプは、CD8 + T細胞は、AIDSへの進行に影響を与える可能性がHIV免疫学の分野において特に有用です。サル免疫不全ウイルス（SIV）とアカゲザルの実験的感染は、エイズウイルスに対する細胞性免疫を研究するための貴重なツールを提供します。その結果、かなりのprogreSSは、この動物モデルにおいてT細胞応答を定義し、特徴付けるてなされたものです。ここでは、のpMHC-I四量体染色によりアカゲザルでSIV特異的CD8 + T細胞を列挙するための最適化されたプロトコルを提示します。私たちのアッセイは、ワクチン接種またはSIV感染によって生成されたSIV特異的CD8 + T細胞応答を追跡するのに有用である可能性がありますテストごとに2つのpMHC-I四量体+ CD8 + T細胞集団の同時定量およびメモリ表現型解析が可能になります。生物医学研究における非ヒト霊長類の妥当性を考慮すると、この方法は、複数の疾患の設定におけるCD8 + T細胞応答を研究するために適用可能です。
Introduction
それらは、腫瘍免疫監視に関与し、細胞内病原体1の撲滅に寄与するようにCD8 + T細胞は、適応免疫系の重要な成分を含みます。簡単に言えば、CD8 + T細胞は、特異的に、宿主細胞の原形質膜上に存在するI（のpMHC-I）分子をペプチド-主要組織適合性複合体クラスを認識するT細胞受容体（TCR）を発現します。これらのペプチドは、内因的に合成されたタンパク質のタンパク質分解に由来するので、細胞表面のpMHC-I複合体は、細胞内環境にウィンドウを提供します。ウイルス感染時に、例えば、感染した細胞は、CD8 + T細胞をパトロールによって発現のTCRに対するリガンドとして機能することができるウイルス由来のペプチドを含むMHC-I分子を表示します。ウイルス特異的CD8 + T細胞は、そののpMHC-Iリガンドを提示する感染細胞を検出した場合には、TCRの関与は、CD8 + T細胞の活性化とultiをもたらしますmately細胞溶解をターゲットにつながります。 CD8 + T細胞応答の大きさ、特異性、および表現型を決定し、これらのTCR /のpMHC-Iの相互作用の重要性を考えると、多くの場合、ヒトの疾患についての重要な手がかりを明らかにすることができます。
1990年代初頭までは、Ag特異的CD8 + T細胞の定量化は、技術的に厳しい限界希釈アッセイ（LDA）2,3に依存していました。だけでなく、LDAが完了するまでに数日必要でしたが、それはまた、増殖能力を欠いていた細胞を検出することができませんでした。その結果、LDAは非常に免疫反応に関与する抗原銀（Ag）特異的CD8 + T細胞を実際の頻度を過小評価しました。 ELISPOTおよび細胞内サイトカイン染色アッセイの開発は非常に細胞性免疫を測定する能力を改善したが、これらの方法は依然としてAg特異的T細胞4を定量するためのインビトロ刺激を必要としました。それは1996年アルトマン、デイビス、および高専までではなかったですeaguesはのpMHC-I四量体技術5の開発を報告し、その画期的な記事を掲載しました。この技術の成功に重要なことにより、フローサイトメトリーアッセイの洗浄ステップ中に脱落のpMHC-I四量体の可能性を低減する、TCR /のpMHC-Iとの相互作用の半減期延長のpMHC-I分子の多量体でした。上記アッセイ上のpMHC-I四量体の主な利点は、正確に、インビトロ再刺激を必要とすることなく、直接ex vivoでのAg特異的CD8 + T細胞を検出する能力です。また、マルチカラーフローサイトメトリーでのpMHC-I四量体染色の組み合わせは、分化段階、メモリー表現型、およびAg特異的CD8 + T細胞2-4の活性化状態の詳細な分析を可能にしました。 6染色多量のpMHC-IによりCD8 + T細胞レパートリーを特徴付けるための最近の技術の進歩を考慮して、アプリケーションの幅FORこの方法論は引き続き拡大する可能性があります。
生物医学研究におけるいくつかの領域は、HIV免疫学7のフィールドよりのpMHC-I四量体染色からより多くの恩恵を受けています。 CD8 + T細胞は、時間的アルトマン、デイビス、と同僚8,9によって公開時点によってHIVウイルス血症の初期制御に関連付けられていたが、その後の年のpMHC-I四量体の使用が大幅に我々の理解を拡大しましたHIV特異的CD8 + T細胞応答。例えば、のpMHC-I四量体染色は、ほとんどのHIV感染者10月12日におけるウイルス特異的CD8 + T細胞応答の強固な大きさを確認助けました。この方法はまた、HIVおよび抗レトロウイルス療法、「エリート制御」として知られる現象の非存在下でのウイルス複製の自発的なコントロールに関連付けられたMHC-I分子によって制限SIV特異的CD8 + T細胞応答の特徴付けを容易に<suP> 13-15。また、のpMHC-I四量体は、制御されていない慢性感染におけるHIV特異的CD8 + T細胞の機能不全の表現型に可逆経路としてプログラム死1（PD-1）/ PDリガンド1（PD-L1）軸の確立に尽力しました16,17。まとめると、これらの研究は、AIDSウイルスに対してCD8 + T細胞応答をモニターするためのpMHC-I四量体の有用性を強調する。
アカゲザル（ アカゲザル ）の実験SIV感染は、HIV / AIDS 18,19に対する免疫介入を評価するための最良の動物モデルのまま。過去25年間で、実質的な進歩がMHC-I対立遺伝子の発見およびペプチド結合モチーフ13,20-27の定義を含め、このサル種におけるSIV特異的CD8 + T細胞の同定および特徴付けになされたもので。その結果、のpMHC-I四量体は、SIV特異的CD8 + T細胞の分析のために開発されていますこの動物モデル28における応答。 MAMU-A1はMAMU-A1は*、001 * 002：：、01 MAMU-B * 008：これらの試薬のほとんどは、4アカゲザルMHC-I対立遺伝子の遺伝子産物で作られている01、およびMAMU-B * 017：01。注目すべきは、アカゲザルは、MHC-C遺伝子座29を発現しません 。本実験で使用したのpMHC-I四量体の大部分はエモリー大学のNIH四量体コア施設で生産されました。それにもかかわらず、免疫優性のGag CM9エピトープに結合MAMU-A1 * 001四量体を含む、これらの試薬のいくつかは、唯一のライセンス契約のために商業的供給源から得ることができます。上記の4つのアカゲザルの対立遺伝子のpMHC-I四量体を使用して、我々は、ワクチン接種またはプライマリSIV感染30,31によって誘導された21 SIVエピトープ（ 表1）の合計に対して、CD8 + T細胞を正常に列挙している（マーチンらら 、未発表の観察）。
現在の原稿が提供しますアカゲザルにおけるSIV特異的CD8 + T細胞の頻度および記憶表現型を決定するためのpMHC-I四量体染色プロトコルを最適化しました。 TCRの内在化を減少させ、それによってのpMHC-I四量体染色32を改善するために、アッセイは、タンパク質キナーゼ阻害剤（ここでは、ダサチニブが使用されるPKI）で待機30分のインキュベーションで始まります。 01四量体：後述するようにMAMU-B * 017を使用している場合、この治療は、特に有用です。蛍光標識のpMHC-I四量体およびモノクローナル抗体（mAb）で細胞を標識する方法の説明も提供されます。このプロトコルはまた、細胞溶解関連分子のグランザイムB（GZM B）の細胞内検出のための細胞透過のステップを含みます。 CD3に対するmAbは、このTCRシグナル伝達分子の検出を向上させるだけでなく、この工程で添加されます。参考として、この染色パネルに用いられる全ての蛍光色素が記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この手順のメリットの議論におけるいくつかのステップは、彼らが最適な結果をもたらすために重要であるとして。生物試料の品質が任意のフローサイトメトリーアッセイ38の成功の強力な予測因子であるので、まず、すべてのケアは、細胞が染色手順の間に実行可能な及び懸濁液中であることを保証するために注意しなければなりません。凍結保存したサンプルで作業するとき、彼…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、本発明の方法論の最適化を可能にした実験を支援するためのデビッド・ワトキンスに感謝したいと思います。この刊行物で報告された研究は、受賞数P30AI073961の下で国立衛生研究所のエイズ研究のためのマイアミセンターが提供するパイロット助成金によって部分的にサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
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