Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia⁺ Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para enumerar e caracterizar macaco rhesus células T CD8 ⁺ contra o vírus da AIDS. Este artigo é útil não só para o campo da imunologia do HIV, mas também a outras áreas de investigação biomédica, onde são conhecidas respostas de células T CD8 ⁺ de afectar a evolução da doença.

Abstract

Péptido-histocompatibilidade principal de classe complexo I (pMHC-I) tetrâmeros têm sido uma ferramenta de valor inestimável para estudar as respostas de células T CD8 ^+. Porque estes reagentes se ligam directamente aos receptores de células T na superfície das células CD8 ⁺ T-linfócitos, tetrâmeros marcado com fluorocromo pMHC-I permitir a detecção exacta do antigénio (Ag) espec�ico CD8 ⁺ células-T, sem a necessidade de re in vitro -estimulação. Além disso, quando combinado com multi-color citometria de fluxo, pMHC-I tetrâmero coloração pode revelar aspectos-chave de células T CD8 ⁺ Ag específicas, incluindo-estágio de diferenciação, fenótipo de memória e estado de activação. Estes tipos de análises têm sido especialmente úteis no campo da imunologia do HIV, onde células T CD8 ⁺ podem afectar a progressão para SIDA. infecção experimental de macacos rhesus com vírus da imunodeficiência símia (SIV) fornece uma ferramenta valiosa para estudar a imunidade celular contra o vírus da AIDS. Como resultado, progre considerávelSS foi feita para definir e caracterizar as respostas de células T neste modelo animal. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para enumerar as células T SIV específicas de CD8 + em macacos rhesus por pMHC-I tetrâmero coloração. Nosso ensaio permite a quantificação e memória fenotipagem simultânea de duas populações de células T pMHC-I tetrâmero + CD8 ⁺ por teste, que pode ser útil para rastrear respostas específicas-SIV de células T CD8 ⁺ geradas pela vacinação ou infecção pelo SIV. Considerando a relevância dos primatas não humanos na investigação biomédica, esta metodologia é aplicável para estudar as respostas das células T CD8 ⁺ em múltiplas configurações de doença.

Introduction

As células T CD8 ⁺ compreendem um componente crucial do sistema imune adaptativo que eles participam no tumor vigilância imune e contribuir para a erradicação dos agentes patogénicos intracelulares ^1. Em termos simples, as células T CD8 ⁺ expressam receptores de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o péptido-classe principal de histocompatibilidade complexo I (pMHC-I) moléculas presentes na membrana plasmática das células hospedeiras. Uma vez que estes péptidos são derivados a partir da proteólise de proteínas sintetizadas endogenamente, pMHC-I da superfície da célula complexos de fornecer uma janela para o meio intracelular. Após a infecção de vírus, por exemplo, as células infectadas irão exibir moléculas de CPH-I que contêm péptidos derivados de vírus que podem servir como ligandos para TCR expressas pelo que patrulha células T CD8 ^+. No caso de uma célula T CD8 ⁺ específicos do vírus encontra uma célula infectada que apresenta o seu ligando pMHC-I, o envolvimento do TCR irá resultar na activação de células T CD8 ⁺ e ultimadamente levar a célula alvo de lise. Dada a natureza crítica dessas interações TCR / pMHC-I, a determinação da magnitude, especificidade e fenótipo de responder as células T CD8 ⁺ podem muitas vezes revelar pistas importantes sobre doenças humanas.

Até o início de 1990, a quantificação de células T Ag específicos de CD8 ⁺ invocado o ensaio tecnicamente exigente diluição limitante (LDA) ^2,3. Não só a LDA requerem vários dias para ser concluído, ele também não conseguiu detectar células que não tinham potencial proliferativo. Como resultado, o LDA vastamente subestimado a frequência real do antigénio (Ag) ⁺ células-T CD8 espec�icos participantes em uma resposta imune. Embora o desenvolvimento de ELISPOT e ensaios de coloração de citocinas intracelulares melhorou grandemente a capacidade de medir a imunidade celular, estes métodos ainda necessário na estimulação in vitro para quantificar as células T específicas de ^Ag-4. Não foi até 1996 que Altman, Davis, e colleagues publicaram seu marco artigo relatando o desenvolvimento da tecnologia de tetrâmero pMHC-I ^5. Crítica para o sucesso desta técnica foi a multimerização de moléculas pMHC-I, que se estendia a meia-vida de interacções TCR / pMHC-I, reduzindo deste modo a probabilidade de tetrâmeros pMHC-I que caem fora durante os passos de lavagem de ensaios de citometria de fluxo. A principal vantagem de tetrâmeros pMHC-I durante os ensaios acima mencionados é a capacidade de detectar com precisão as células T Ag-CD8 ⁺ específica directamente ex vivo, sem a necessidade de in vitro re-estimulação. Além disso, a combinação de pMHC-I tetrâmero coloração com multi-cor citometria de fluxo permitiu uma análise detalhada do andar de diferenciação, fenótipo de memória, e o estado de activação das células T CD8 ⁺ específicas de células ^Ag-2-4. À luz dos recentes avanços técnicos para a caracterização de repertórios de células T CD8 ⁺ por pMHC-I multimero coloração ^6, a amplitude de aplicações for esta metodologia é provável que continue em expansão.

Poucas áreas da pesquisa biomédica beneficiaram mais do pMHC-I tetrâmero coloração do que o campo da imunologia HIV ^7. Embora as células T CD8 ⁺ foi temporariamente associado com o controle inicial de viremia HIV no momento da publicação por Altman, Davis, e seus colegas ^8,9, o uso de tetrâmeros pMHC-I nos anos seguintes expandiu significativamente a nossa compreensão da o HIV-resposta específica das células T CD8 ^+. Por exemplo, pMHC-I tetrâmero coloração ajudou a confirmar o tamanho robusta de respostas de células T CD8 ⁺ específicas do vírus, na maioria dos indivíduos infectados com HIV ^10-12. Esta metodologia também facilitou a caracterização de HIV e respostas de células T específicas de SIV CD8 ⁺ restringidos por moléculas de MHC-I associados com um controle espontâneo de replicação virai na ausência de terapia anti-retroviral, um fenómeno conhecido como "controlo de elite" <sup> 13-15. Além disso, pMHC-I tetrâmeros foram instrumental no estabelecimento do eixo morte programada 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) como uma via reversível para o fenótipo disfuncional de HIV-específicas CD8 ⁺ células-T na infecção crônica não controlada ^16,17. Coletivamente, esses estudos ressaltam a utilidade de tetrâmeros pMHC-I para monitorar as respostas de células T CD8 ⁺ contra o vírus da AIDS.

Infecção experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) continua a ser o melhor modelo animal para avaliação das intervenções imunes contra o HIV / AIDS ^18,19. Nos últimos 25 anos, um progresso substancial tem sido feito na identificação e caracterização de células T CD8 específicas ^SIV-+ nesta espécies de macacos, incluindo a descoberta de alelos de MHC-I e a definição de ligação ao péptido motivos ^13,20-27 . Como resultado, I-pMHC tetrâmeros ter sido desenvolvido para a análise de SIV-específica de células T CD8 ⁺respostas neste modelo animal ^28. A maioria destes reagentes são feitas dos produtos de gene de quatro macaco rhesus alelos do MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. De nota, macacos rhesus não expressam um locus MHC-C ^29. A grande maioria dos tetrâmeros pMHC-I utilizados nas presentes experiências foram produzidas no Centro de NIH tetrâmero Núcleo da Universidade de Emory. No entanto, alguns destes reagentes, incluindo Mamu-A1 * 001 tetrâmeros ligados ao imunodominante epitopo Gag CM9, só pode ser obtido a partir de fontes comerciais devido a acordos de licenciamento. Usando tetrâmeros pMHC-I dos quatro alelos rhesus listados acima, temos enumerado com êxito as células T CD8 ⁺ contra um total de 21 epitopos SIV (Tabela 1), que foram induzidos por vacinação ou infecção pelo SIV primário ^30,31 (Martins et al., observações não publicadas).

O presente manuscrito fornece umaoptimizado pMHC-I protocolo de coloração do tetrero para a determinação do fenótipo de células T específicas SIV-CD8 ⁺ frequência e memória em macacos rhesus. O ensaio começa com um electiva 30 min de incubação com um inibidor de proteína cinase (PKI; aqui, dasatinib é utilizado), a fim de diminuir a internalização de TCR e, assim, melhorar a pMHC-I tetrâmero coloração ^32. Como descrito abaixo, o tratamento é especialmente útil quando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. Instruções sobre como rotular as células com tetrâmeros pMHC-I fluorocromo conjugado e anticorpos monoclonais (mAbs) também são fornecidos. Este protocolo inclui também um passo para a permeabilização celular para a detecção intracelular da molécula associada à citólise granzima B (GZM B). O anticorpo monoclonal contra CD3 é adicionado neste passo, assim como para melhorar a detecção desta molécula de sinalização de TCR. Como uma referência, todos os fluorocromos utilizados no presente painel de coloração são listados.

Protocol

As amostras de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) utilizados neste manuscrito foram obtidos a partir de macacos rhesus Indiana alojados no Wisconsin National Primate Research Center. Estes animais foram tratados de acordo com o Relatório de Weatherall sob um protocolo aprovado pela Universidade de Wisconsin Animal Care Graduate School e Use Committee 33. Todos os procedimentos com animais foram realizados sob anestesia e todos os esforços foram feitos para minimizar o potencial sofrimento. <p class="jove_ti…

Representative Results

O protocolo aqui descrito foi usado para determinar a magnitude e a memória de fenótipo, as respostas de células T induzidas por vacina Gag CM9-específicas de CD8 + em uma Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Para esta análise, um tetrâmero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 APC-conjugado foi usado em um painel de coloração de citometria de fluxo de 8 cores. Figura 1A – F mostra a estratégia gating usado para analisar os dados, que devem ser …

Discussion

A poucos passos nesta discussão mérito procedimento como eles são cruciais para produzir resultados ideais. Em primeiro lugar, uma vez que a qualidade das amostras biológicas é um forte indicador de sucesso de qualquer ensaio de citometria de fluxo ^38, devem ser tomados todos os cuidados para garantir que as células são viáveis e em suspensão durante o processo de coloração. Isto é particularmente relevante quando se trabalha com amostras criopreservadas, uma vez que são mais propensas a aglomera…

Materials

Dasatinib	Axon medchem	Axon 1392	Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C
RPMI w/ Glutamax	gibco/ Life Technologies	61870-036	Must be stored at 4 °C
Heat Inactivated FBS	gibco/ Life Technologies	10082-147	Must be stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B	Lonza	17-745E	Must be stored at 4 °C
DMSO, Anhydrous	Life Technologies	D12345	Store at room temperature.
5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes	VWR	60819-728
Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers	NIH Tetramer Core or MBL, Inc.		Must be stored and maintained at  4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze.
Fluorochrome-conjugated mAbs	Various companies		Must be stored and maintained at  4 °C. Do not freeze.
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	l34957	Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use.
Brilliant Stain Buffer	BD Biosciences	563794	Must be stored at  4 °C
Phosphate Buffered Saline	VWR	97064-158	Store at room temperature
Albumine Bovine	VWR	700011-230	Must be stored at  4 °C
Sodium Azide	VWR	97064-646	Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach.
Bleach	VWR	89501-620	Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care
Polysorbate 20 (Tween-20)	Alfa Aesar	L15029	Store at room temperature
Permeabilization Solution 2	BD Biosciences	340973	Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Sarsdet Tubes 1.5mL screw top	VWR	72.692.005
2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes	Eppendorf	22431048	The use of Sterile microtubes is preffered
Vortex mixer	To discretion of scientist
Biosafety Cabinet	To discretion of scientist
Milli Q Intergral Water Purification system	EMD Millipore	ZRXQ010WW	Molecular Biology grade water from any provider may be used
Microcentrifuge	To discretion of scientist
Centrifuge	To discretion of scientist
4 °C  refrigerator	To discretion of scientist
BD LSR II	BD Biosciences		Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Deionized water
Aluminum Foil	VWR SCIENTIFIC INC.	89068-738
Incubator			Must be able to maintain 37 °C  internal temperature
FACS Diva software	BD Biosciences
Flowjo software version 9.6	Flowjo		Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software
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