रैखिक Agarose चैनलों का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए<em> ड्रोसोफिला</em> लारवल रेंगने व्यवहार
Summary
ड्रोसोफिला लार्वा व्यवहार के तंत्रिका नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। इस प्रकाशन रेखीय agarose चैनलों के उपयोग रैखिक रेंगने और विधियों की निरंतर मुकाबलों बटोर दोहराए रेंगने व्यवहार के दौरान लार्वा संरचनाओं की गतिशीलता यों तो वर्णन करता है।
Abstract
ड्रोसोफिला लार्वा रेंगने ज्ञानेन्द्रिय व्यवहार के तंत्रिका नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में उभर रहा है। , रोक मोड़, और meandering: हालांकि, फ्लैट खुला सतहों पर लार्वा रेंगने व्यवहार सहित जटिल है। आंदोलन के प्रदर्शनों की सूची में इस जटिलता की घटनाओं के लिए एक एकल क्रॉल प्रगति चक्र के दौरान होने वाली का विस्तृत विश्लेषण hinders। इस बाधा को दूर करने के लिए, रैखिक agarose चैनलों किए गए थे कि सीधे, निरंतर, लयबद्ध रेंगने के लार्वा व्यवहार विवश। सिद्धांत रूप में, क्योंकि agarose चैनलों और ड्रोसोफिला लार्वा शरीर दोनों ऑप्टिकली स्पष्ट कर रहे हैं, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जांच द्वारा लेबल लार्वा संरचनाओं के आंदोलन बरकरार, लार्वा को स्वतंत्र रूप से चलती नजर रखी जा सकती है। अतीत में, लार्वा रैखिक चैनलों में रखा गया था और पूरे जीव, खंड के स्तर पर रेंगने, और मांसपेशियों 1 विश्लेषण किया गया। भविष्य में, लार्वा चैनलों में रेंगने न्यूरो नजर रखने के लिए कैल्शियम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकताएनएएल गतिविधि। इसके अलावा, इन तरीकों में से किसी भी जीनोटाइप के लार्वा के साथ और किसी भी शोधकर्ता से डिजाइन चैनल के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार से नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल मोटर नियंत्रण समझने के लिए एक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला लार्वा का उपयोग करते हुए अध्ययन के लिए व्यापक रूप से लागू है।
Introduction
इस विधि के समग्र लक्ष्य के बारे में विस्तार से ड्रोसोफिला लार्वा रेंगने का अध्ययन है। हरकत पर प्रयोगों के विकास और मोटर नियंत्रण 2 पर सिद्धांतों का परीक्षण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। परंपरागत रूप से हरकत जलीय जानवर (जैसे, जोंक, एक प्रकार की मछली, मेढक) 3 में अध्ययन किया गया है। इन जानवरों में हरकत का दोहराव प्रकृति rhythmogenesis के अध्ययन के लिए अनुमति दी गई है, हरकत ड्राइविंग biophysical घटनाओं के विश्लेषण के लिए, और तंत्रिका गोलीबारी पैटर्न है कि हरकत के साथ निगरानी के लिए।
सतही आनुवंशिकी, अच्छी तरह से विशेषता विकास, एक शरीर है कि पहले और दूसरे instars पर ऑप्टिकली स्पष्ट है, और पूरे के चल रहे एक संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म पुनर्निर्माण: हरकत की पढ़ाई के लिए ड्रोसोफिला लार्वा का उपयोग अन्य मॉडल प्रणाली अधिक लाभ की एक अद्वितीय संयोजन प्रस्तुत करता है तंत्रिका तंत्र 4-6। हालांकि, ड्रोसोफिला लार्वा लोकोफ्लैट खुले सतहों पर गति रुक जाता सहित कुछ हद तक जटिल है, बदल जाता है, और चकरा देने वाली क्रॉल 7। इस प्रकाशन रेखीय agarose चैनलों का उपयोग करने के लिए ड्रोसोफिला लार्वा हरकत व्यवहार मार्गदर्शन करने के लिए कि इस तरह के लार्वा निरंतर प्रदर्शन करते हैं, सीधे, लयबद्ध रेंगने व्यवहार एक विधि प्रस्तुत करता है।
, Agarose चैनलों में ड्रोसोफिला लार्वा व्यवहार का अध्ययन फ्लैट खुला सतहों पर व्यवहार करने के बजाय, कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से कई आंदोलनों कि लार्वा व्यवहार प्रदर्शनों की सूची का हिस्सा हैं से व्यवहार रेंगने चयन करने के लिए अनुमति देता है। दूसरा, बनाम लार्वा शरीर के आकार चैनल की चौड़ाई का समायोजन करके, रेंगने की गति समायोजित किया जा सकता है। तीसरा, चैनलों के लिए लार्वा कैसे लार्वा भरी हुई है और चैनल के भीतर उन्मुख है के आधार पर पृष्ठीय, उदर, या पार्श्व की ओर से देखा जा करने के लिए अनुमति देते हैं। लार्वा अभिविन्यास में इस बहुमुखी प्रतिभा के हित के किसी भी संरचना रेंगने के दौरान लगातार दिखाई करने के लिए अनुमति देता है। चौथा,चैनलों सूक्ष्मदर्शी और उद्देश्यों की एक विस्तृत विविधता के साथ प्रयोग के लिए उत्तरदायी हैं। उदाहरण के लिए, रैखिक चैनलों उज्ज्वल क्षेत्र stereoscopes और / या कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी 1 पर उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए पर कम संकल्प इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पांचवां, इस विधि के किसी भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि में optogenetic / thermogenetic न्यूरोनल जोड़तोड़ के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है। अंत में, क्योंकि दोनों लार्वा शरीर (पहले और दूसरे instars पर) और agarose चैनलों ऑप्टिकली स्पष्ट कर रहे हैं, जब चैनलों गतिशील आंदोलनों, या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जांच द्वारा लेबल लार्वा संरचनाओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
विधि वर्णित पहली और दूसरी instar ड्रोसोफिला लार्वा व्यवहार की विस्तृत विज्ञान सम्बन्धी अध्ययन के लिए उपयुक्त है। इस प्रकाशन चैनलों के उपयोग के प्रदर्शन को आगे लार्वा रेंगने के दौरान सीएनएस के फ्लोरोसेंट तीव्रता में गतिशील परिवर्तन का विश्लेषण करती है और एक अग्रदूत के रूप में करने के लिए NeuRonal कैल्शियम इमेजिंग।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक microfluidic युक्ति रेखीय agarose चैनलों कि ड्रोसोफिला लार्वा को समायोजित कर सकते हैं (चित्रा 1) बनाने के लिए बनाया गया था। ड्रोसोफिला लार्वा इन रैखिक agarose चैनलों में रखा जाता है जब उनके व्यवहार प्रदर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
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