Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen
Summary
Wir haben eine kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung zur Verwendung mit optogenetische Systeme Kulturen von Mikroben zu beleuchten und regelmäßig Bildzellen in dem Abwasser mit einem umgekehrten Mikroskop. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind voll automatisiert, so dass dynamische Reaktionen auf Beleuchtung kann über mehrere Tage gemessen werden.
Abstract
Optogenetische Systeme verwenden genetisch kodierten Proteine, die Konformation in Reaktion auf bestimmte Wellenlängen des Lichts verändern zellulärer Prozesse zu verändern. Es besteht ein Bedarf für die Kultivierung und Messsysteme, die Beleuchtung und die Stimulation von optogenetische Systeme programmiert einzuarbeiten. Wir stellen ein Protokoll für den Aufbau und die Verwendung eines kontinuierlichen Kultivierungsvorrichtung mikrobiellen Zellen mit programmierter Dosen von Licht zu beleuchten, und automatisch erfassen und die Bilder der Zellen in dem Ausfluß zu analysieren. Der Betrieb dieser Vorrichtung als Chemostat ermöglicht die Wachstumsrate und der Zellumgebung streng kontrolliert werden. Der Austrag der kontinuierlichen Zellkulturen werden regelmäßig Proben genommen und die Zellen werden durch Mehrkanal-Mikroskopie abgebildet. Die Kultivierung, Probenahme, Bildverarbeitung und Bildanalyse sind vollständig automatisiert, so dass dynamische Reaktionen in der Fluoreszenzintensität und zellulärer Morphologie von aus der Kultur Abstrom abgetastete Zellen über mehrere Tage gemessenohne Benutzereingabe. Wir zeigen die Nützlichkeit dieser Kultivierungsvorrichtung durch dynamisches Protein – Produktion in einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae konstruiert mit einem optogenetische System induziert die Transkription aktiviert.
Introduction
Optogenetische Systeme verwenden Licht eine wachsende Liste von zellulären Prozessen , einschließlich Expression Gens zu kontrollieren, 1, 2, 3, 4, 5 Proteinlokalisierung, 6 – Protein – Aktivität, 6, 7, 8 Proteinbindungs, 8, 9, 10 und den Proteinabbau. 11 Verfahren für Zellen in einer kontrollierten Umgebung mit programmierten optischen Stimulation und zum Messen von deren Reaktion über biologisch relevanten Zeitskalen Züchten ist notwendig , das Potential dieser Werkzeuge für die Forschung in der Zellbiologie und der Biotechnologie zu nutzen. Unsere Methode nutzt chemostasis eine konstante Zellwachstumsrate in einem gut gemischten aufrechtzuerhalten, aegelesen und temperaturgeregelten Glaskulturgefäß 12, 13, die so programmiert Beleuchtung ausgesetzt ist. Wir Bild einzelnen Zellen in der Kultur Abstrom mit einem umgekehrten Mikroskop die Reaktion der Kultur zu programmierten Beleuchtungs zu messen. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind vollständig automatisiert, so dass die Fluoreszenzintensität und Zellmorphologie des Abflusses Zellkultur kann über mehrere Tage ohne Benutzereingabe gemessen werden.
Dieses Protokoll kann in den meisten Labors vertraut mit wachsenden Zellkultur und Mikroskopie durchgeführt werden, und die verwendete Vorrichtung ist kostengünstig und aus leicht verfügbaren Komponenten. Ein transparentes Kulturgefäß über einer Matrix aus Leuchtdioden (LEDs) emittieren kann 1 & mgr; W / cm 2 -10 mW / cm 2 von Licht angeordnet. Mikroben werden in dem Kulturgefäß kontinuierlich gewachsen; eine peristaltische Pumpe verwendet Medien bei der hinzufügenVerdünnungsrate wird eine andere verwendet Kultur mit einer geringeren Rate an das Mikroskop zurückzuziehen, und die Differenz entweicht durch einen Überlaufauslaß. Ein Heizkissen hält die Temperatur. Die Luft wird kontinuierlich in das Kulturgefäß gepumpt, um einen positiven Druck als auch zu halten, wie zu mischen und die Kultur belüften. Mit Ausnahme der Luftpumpe, Leistung dieser Vorrichtungen wird durch einen Mikrocontroller geregelt, die auch eine Eingabe von einem Thermometer und einem angeschlossenen Desktop-Computer empfängt. Der Abstrom Zellkultur wird auf eine Mikrofluidik-Vorrichtung auf der Bühne eines umgekehrten Mikroskops gepumpt. Nicht fluoreszierende und Fluoreszenzbilder werden automatisch erfasst. Die Zellen in den Bildern durch einen Algorithmus gekennzeichnet, daß jede Zelle als eine Region von Interesse (ROI) lokalisiert und mißt die Eigenschaften der einzelnen ROI.
Um eine Anwendung dieses Protokolls zu demonstrieren, maßen wir die Antwort auf unterschiedlichen Lichtintensitäten von Saccharomyces cerevisiae – Zellen entwickelt , mit einem Blaulicht Verantve optogenetische System, das die Transkription von fluoreszierenden Proteins steuert. S. cerevisiae, wie Bäckerhefe allgemein bekannt ist , wurde ausgewählt , weil mehrere optogenetische Systeme für die bereits in diesem System Genexpression Steuerung 14 vorhanden ist , 15, 16. Darüber hinaus ist dieses Modellorganismus für Studien in der Systembiologie 17 und als Fahrgestell für biotechnologische Anwendungen 18, 19, 20 verwendet. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, die Transkription einer Kultur über mehrere Tage zu steuern, indem Eingangslichtintensitäten variierende und die Herstellung eines fluoreszierenden Reporter messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben dieses Gerät mit Flexibilität im Auge behalten. Der gesamte Code verwendet wird, ist kostenlos und Open-Source. Die Standard-Bildanalyseprozess Segment Zellen ist einfach und schnell läuft. Benutzerdefinierte Analyse könnte durch die Aufzeichnung von Benutzereingaben durchgeführt werden, während ein repräsentatives Bild mit der FIJI grafischen Benutzeroberfläche Analyse, Umwandlung der Eingabe in ein Skript Beanshell und dann Setzen des Plugin, das Skript zu nennen. Wenn es aufgerufen wird, wird das Sk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten, dass bei der Prüfung der Protokoll, Kieran Sweeney für hilfreiche Diskussionen und Bearbeitung, und Taylor Scott, My An-adirekkun und Stephanie Geller für das kritische Lesen des Manuskripts Molly Lazar und Verónica Delgado für die Unterstützung zu bestätigen. Megan Nicole McClean, Ph.D. hält an der Scientific-Schnittstelle vom Burroughs Wellcome Fund ein Career Award.
Materials
| Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
| Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
| Arduino Uno R3 (Atmega328 – assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
| Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
| Adjustable 30W 110V soldering iron – XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Mini Solder spool – 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter – 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| 0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| 10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver – MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
| 8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
| 24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
| Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
| Break Away Headers – 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
| Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
| Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
| Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
| Miniature 8×8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
| Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
| Resistor Kit – 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
| IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
| 5V 2A (2000mA) switching power supply – UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
| 12 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
| Electric Heating Pad – 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
| Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
| Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
| 9 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
| High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
| Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
| FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
| Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
| Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| USB Cable A to B – 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
| bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
| Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
| Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 – 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
| Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
| 100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
| Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
| Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
| 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
| Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
| 2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
| Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
| Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
| Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
| Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
| 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
| Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
| 0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
| Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
| American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
| Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
| Microscope cover glass 22×60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
| Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |
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