鍼治療によりラットとマウスにおけるてんかんElectrocorticograms（ECoGs）の操作とスリープ
Summary
This paper demonstrates the performance of acupuncture, epilepsy models, and the analysis of sleep in rodents. The acupuncture procedure and the identification of acupoints are described. Pilocarpine or pentylenetetrazol (PTZ) is used to induce epilepsy. Electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), brain temperature, and locomotor activity recordings are employed for sleep analysis.
Abstract
Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little research to reveal the possible mechanisms behind these effects. To investigate the effect of acupuncture on epilepsy and sleep, several issues need to be addressed. The first is to identify the acupoints, which correspond between humans, rats, and mice. Furthermore, the depth of insertion of the acupuncture needle, the degree of needle twist in manual needle acupuncture, and the stimulation parameters for electroacupuncture (EA) need to be determined. To evaluate the effects of acupuncture on epilepsy and sleep, a feasible model of epilepsy in rodents is required. We administer pilocarpine into the left central nucleus of the amygdala (CeA) to simulate focal temporal lobe epilepsy (TLE) in rats. Intraperitoneal (IP) injection of pilocarpine induces generalized epilepsy and status epilepticus (SE) in rats. Five IP injections of pentylenetetrazol (PTZ) with a one-day interval between each injection successfully induces spontaneous generalized epilepsy in mice. Recordings of electrocorticograms (ECoGs), electromyograms (EMGs), brain temperature, and locomotor activity are used for sleep analysis in rats, while ECoGs, EMGs, and locomotor activity are employed for sleep analysis in mice. ECoG electrodes are implanted into the frontal, parietal, and contralateral occipital cortices, and a thermistor is implanted above the cerebral cortex by stereotactic surgery. EMG electrodes are implanted into the neck muscles, and an infrared detector determines locomotor activity. The criteria for categorizing vigilance stages, including wakefulness, rapid eye movement (REM) sleep, and non-REM (NREM) sleep are based on information from ECoGs, EMGs, brain temperature, and locomotor activity. Detailed classification criteria are stated in the text.
Introduction
てんかんは、再発性発作が患者の寿命全体で発生する一般的な神経疾患です。最もてんかん再発は、抗てんかん薬（抗てんかん薬）によって十分に制御することができます。しかし、てんかん患者の約30％は、難治性てんかん1を開発しています。てんかんは、さらに再発を悪化させる可能性睡眠障害を引き起こします。証拠は、てんかんが夜に睡眠を妨害することがありいずれか、または日中の過度の眠気の2,3を引き起こす可能性があることを示しています。我々の以前の研究はさらにzeitgeber時間（ZT）0、すなわちで発生することてんかんを示し、光の光期間の開始：暗サイクルは、睡眠を減少させます。これは、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）、恒常性因子によって媒介されます。 ZT13（暗期の初め）にてんかん、睡眠を増加させる別の恒常性因子、インターロイキン-1（IL-1）の発現を増強します。概日リズムをスリープてんかんはZT6、の途中で発生した場合に変更されます明期4,5。一方、睡眠の問題は、さらにてんかん6の進行や再発を悪化させます。前述の証拠に基づいて、我々は同時に、てんかんを制御し、てんかん患者における睡眠の混乱を防止するための最適な治療法を明らかにしてみてください。我々は以前正常皮質脳波を（ECOG）てんかん活動とてんかん誘発性睡眠障害を抑制し、電流の一定量をステンレススチール針を通して経穴に送達された10-Hzの刺激周波数でその電気針（EA）に見出さ7 。 100 Hzの刺激周波数を持つEAはさらに、ラット8,9にてんかん活動と睡眠の中断を劣化させます。この成功した実験では、3つの要因によって決まります。まず、実現可能なてんかん動物モデル;第二に、げっ歯類における睡眠記録および分析のための方法。第三に、鍼治療の正確なパフォーマンスとツボlocatiの精度アドオン。
焦点てんかんと一般化てんかん：てんかんは、2つの主要なタイプに分類されています。私たちは、焦点側頭葉てんかん（TLE）、全般てんかん、てんかん重積状態（SE）、および自発性全般てんかんの再発に興味を持っています。したがって、別の操作は、実験に適したてんかんモデルを作成するために適用されます。焦点TLEを確立するには、ピロカルピンの低用量は、扁桃体（CEA）の左中央の核内に投与されます。このモデルを検証するために、6 ECOG電極は正面（F1＆F2）、頭頂部（P1＆P2）、および後頭部（O1＆O2）、左右両半球でローブに移植し、他の二つの基準電極（R1＆されていますR2）が両半球における小脳の上に配置されています。追加のマイクロインジェクションガイドカニューレを外科的に左CEA（; ML、4.2ミリメートル、DV、ブレグマを基準に7.8ミリメートルAP、ブレグマから2.8ミリメートル）に移植されます。座標は、PaxinosとWから適応されていますラットアトラス10 atson。焦点TLEが正常に誘導されている場合は、左のCEAの近くにある左頭頂皮質上の電極（P1）からのみ記録、他のECOGの電極から記録されていない重要なてんかん様ECoGsで、支配的なてんかん様ECoGsを取得する必要があります。ラットへの腹腔内ピロカルピンの（IP）注射が一般化てんかんやSEを誘発するが、これは致命的なことができます。各注入の間に1日間隔でペンチレンテトラゾール（PTZ）の五IP注射は、正常マウスでは、自発全般てんかんを誘発し、また、マウスの生存を確認してください。二線ECOG電極がECOG信号を受信すると自発的に再発性てんかんを確認するために、マウスにおける前頭葉および頭頂葉皮質に注入されます。
睡眠ポリグラフ（PSG）は、睡眠中に起こる生理的変化を記録するための包括的な方法であり、それは客観的、非急速眼球運動（NREM）とrの異なる段階に睡眠を分類することができますAPIDの眼球運動（REM）睡眠。 PSGは、脳波（脳波、EEG）、眼球運動（電図、EOG）、骨格筋トーン（電、EMG）、心拍リズム（心電図、ECG）、および血中酸素濃度と呼吸パラメータを含む身体機能のパラメータを、記録します。ラットでは、我々は覚醒、ノンレム睡眠、レム睡眠に警戒状態を分類するECoGs、筋電図、皮質温度、および自発運動を記録します。マウスでの睡眠分析はECoGs、筋電図、および自発運動の結果を用いて行われます。ラットを外科的に前頭葉、頭頂葉、および定位手術による対側小脳皮質で3 ECOGスクリュー電極を移植されています。警戒状態（覚醒、ノンレム睡眠、レム睡眠）の買収後の決意はECoGs、EMG、脳の温度、および自発運動から取得したパラメータに従って実施されます。ラットとマウスの両方で、動物の行動を分類するための詳細な基準は、トンで説明されています彼は、プロトコル。
ラットとマウスの両方が手動鍼やEAを実行する前に、正常に定位手術中に投与麻酔薬の半分の投与量であるzoletilの低用量（25mgの/キログラム）、で麻酔する必要があります。この投与量は、動物は、注射後30〜35分をウェイクアップすることができます。手動鍼またはEAのいずれかが30分の一定時間で、暗期の開始時に行われ、各動物は、連続的に2〜3日間処理されます。刺激EA電流は、ツボに挿入されたステンレス製の針を介して特定のツボに配信されます。刺激電流は、二相性方形パルス列であり、これは、パルス持続時間は150ミリ秒であり、刺激強度を1 mAです。ドライニードル手動鍼治療のために使用される場合、ツボに挿入された針は、10回ごとに5分ひくれます。マニュアル鍼やEAの難しい部分はげっ歯類でツボをローカライズすることです。 LOCラットやマウスでのツボのationがヒトにおける解剖学的位置に似ています。例えば、二国間Fengchiのツボは、ヒト11での解剖学的位置に似ている両耳の間に、3ミリメートル離れて首に後部正中線から位置しています。さらに、皮膚上の低インピーダンスでツボをさらに確認することができます。シャム鍼または偽EA操作は、鍼やEAの実験のために必要です。シャム鍼または偽EAは、腋窩12近くに、近いツボに位置する非経穴で実行されなければなりません。
正常にてんかんおよびてんかん誘発性睡眠の中断に鍼やEAの効果を調べるために、以下の要因は、所定の位置になければなりません：実行可能なてんかん動物モデル、てんかん様ECoGsとてんかんの再発の正確な分析、警戒状態を分類する方法げっ歯類での鍼治療やEAの、そして正確なパフォーマンス。
Protocol
Representative Results
Discussion
実現可能なてんかん動物モデルを選択すると、各実験の目的のために不可欠です。私たちの目標の一つは、てんかん抑制に対するEAの影響を明らかにすることです。 EAは、てんかんに治療効果を示すことができるし、古代中国の文献に記載されている代替医療です。しかし、それを証明する科学的証拠の欠如があります。てんかんに対するEAの効果を決定するために、我々は主に軽度の焦点て…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Ministry of Science and Technology (MOST) grants MOST104-2410-H-002-053 & NSC99-2320-B-002-026-MY3. This manuscript was edited and proofread by Mr. Brian Chang, who has experience revising professional documents.
Materials
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X. Predictors of sleepiness in epilepsy patients. Sleep. 20 (12), 1105-1110 (1997).
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W. Sleep and epilepsy. Semin Neurol. 22, 321-327 (2002).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at ‘Anmian’ (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
