Manipulering av Epileptiforma Electrocorticograms (ECoGs) och sömn hos råttor och möss genom akupunktur
Summary
This paper demonstrates the performance of acupuncture, epilepsy models, and the analysis of sleep in rodents. The acupuncture procedure and the identification of acupoints are described. Pilocarpine or pentylenetetrazol (PTZ) is used to induce epilepsy. Electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), brain temperature, and locomotor activity recordings are employed for sleep analysis.
Abstract
Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little research to reveal the possible mechanisms behind these effects. To investigate the effect of acupuncture on epilepsy and sleep, several issues need to be addressed. The first is to identify the acupoints, which correspond between humans, rats, and mice. Furthermore, the depth of insertion of the acupuncture needle, the degree of needle twist in manual needle acupuncture, and the stimulation parameters for electroacupuncture (EA) need to be determined. To evaluate the effects of acupuncture on epilepsy and sleep, a feasible model of epilepsy in rodents is required. We administer pilocarpine into the left central nucleus of the amygdala (CeA) to simulate focal temporal lobe epilepsy (TLE) in rats. Intraperitoneal (IP) injection of pilocarpine induces generalized epilepsy and status epilepticus (SE) in rats. Five IP injections of pentylenetetrazol (PTZ) with a one-day interval between each injection successfully induces spontaneous generalized epilepsy in mice. Recordings of electrocorticograms (ECoGs), electromyograms (EMGs), brain temperature, and locomotor activity are used for sleep analysis in rats, while ECoGs, EMGs, and locomotor activity are employed for sleep analysis in mice. ECoG electrodes are implanted into the frontal, parietal, and contralateral occipital cortices, and a thermistor is implanted above the cerebral cortex by stereotactic surgery. EMG electrodes are implanted into the neck muscles, and an infrared detector determines locomotor activity. The criteria for categorizing vigilance stages, including wakefulness, rapid eye movement (REM) sleep, and non-REM (NREM) sleep are based on information from ECoGs, EMGs, brain temperature, and locomotor activity. Detailed classification criteria are stated in the text.
Introduction
Epilepsi är en vanlig neurologisk sjukdom där återkommande anfall inträffar under en patients livslängd. De flesta epileptiska återfall kan väl kontrollerad av antiepileptika (AED). Men cirka 30% av epileptiska patienter utvecklar refraktär epilepsi en. Epilepsi orsakar sömnstörningar, vilket ytterligare kan förvärra återfall. Bevis för att epilepsi antingen kan störa sömnen på natten eller kan orsaka överdriven sömnighet under dagen 2,3. Våra tidigare studier visar vidare att epilepsi inträffar vid zeitgeber tid (ZT) 0, dvs början av den ljusa perioden i ljuset: mörker-cykel, minskar sömn; detta medieras av kortikotropinfrisättande hormon (CRH), en homeostatisk faktor. Epilepsi vid ZT13 (början av den mörka perioden) förstärker uttrycket av en annan homeostatisk faktor, interleukin-1 (IL-1), vilket ökar sömn. Sömndygnsrytmen ändras när epilepsi inträffar vid ZT6, i mitten avljusa perioden 4,5. Å andra sidan, sömnproblem förvärra ytterligare progression och återfall av epilepsi 6. Baserat på ovanstående bevis, vi försöker avslöja en optimal terapeutisk metod för att samtidigt styra epilepsi och förebygga sömnstörningar hos epilepsipatienter. Vi fann tidigare att elektroakupunktur (EA) med en 10-Hz stimulering frekvens, i vilken en viss mängd ström levereras till acupoint genom ett rostfritt stål nål, framgångsrikt undertrycker electrocorticogram (ECOG) epileptiska aktiviteter och epilepsi inducerad sömnstörningar 7 . EA med en 100-Hz stimulering frekvens försämras ytterligare epileptiska aktiviteter och sömnstörningar hos råttor 8,9. Denna framgångsrika experiment beror på tre faktorer: för det första, en möjlig epileptiskt djurmodell; för det andra, en metod för sömn registrering och analys i gnagare; och för det tredje, den exakta prestanda akupunktur och noggrannheten i acupoint locations.
Epilepsi har kategoriseras i två huvudtyper: fokal epilepsi och generaliserad epilepsi. Vi är intresserade av fokal Temporallobsepilepsi (TLE), generaliserad epilepsi, status epilepticus (SE), och återkommande spontana generaliserad epilepsi. Därför olika manipulationer tillämpas för att skapa lämpliga epileptiska modeller för våra experiment. Att upprätta fokal TLE, är en låg dos av pilokarpin administrerades i den vänstra centrala kärnan av amygdala (CEA). För att verifiera denna modell, är sex ECOG elektroder implanteras på den främre (F1 och F2), parietal (P1 & P2), och skallbenet (O1 och O2) lober i både vänster och höger halvklot, och ytterligare två referenselektroder (R1 & R2) placeras över lillhjärnan i båda halvkloten. En ytterligare mikroinjektion guide kanyl kirurgiskt implanteras i vänster CEA (AP, 2,8 mm från bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 mm i förhållande till bregma). Koordinaterna är anpassade från Paxinos och Watson råtta atlas 10. Om bränn TLE framgångsrikt induceras endast inspelningen från elektroden till vänster parietal cortex (P1), som ligger nära den vänstra CEA bör förvärva dominerande epileptiforma ECoGs, med inga signifikanta epileptiforma ECoGs som spelats in från andra ECOG elektroderna. Intraperitoneal (IP) injektioner av pilokarpin till råttor inducera generaliserad epilepsi och SE, men detta kan vara dödlig. Fem IP injektioner av pentylentetrazol (PTZ) med en dags intervall mellan varje injektion framgångsrikt inducera spontan generaliserad epilepsi hos möss och även se till mössens överlevnad. Två tråd ECOG elektroder implanteras i cortex frontal- och parietal i möss för att ta emot ECOG signaler och för att kontrollera spontant återkommande epilepsi.
Polysomnografi (PSG) är en omfattande metod för att registrera fysiologiska förändringar som sker under sömnen, och det kan objektivt klassificera sömn i olika stadier av icke-snabba ögonrörelser (NREM) och rAPID ögonrörelser (REM) sömn. PSG registrerar parametrar för kroppsfunktioner, inklusive hjärnvågor (elektroencefalogram, EEG), ögonrörelser (electrooculogram, EOG), skelettmuskel toner (elektromyogram, EMG), hjärtrytm (EKG, EKG), och blodet syre och respiratoriska parametrar. Hos råttor, vi spela ECoGs, EMGs, kortikal temperatur och rörelseaktivitet att klassificera vaksamhet stater i vakenhet, NREM sömn och REM-sömn. Sömn analys i möss genomförs med hjälp av ECoGs, EMGs och rörelseaktivitet resultat. Råttor inopererade med tre ECOG skruv elektroder vid den främre, parietalceller och kontra cerebellära cortex av stereotaktisk kirurgi. Efter förvärvet bestämning av vaksamhet stater (vakenhet, NREM sömn och REM-sömn) genomförs enligt de parametrar som förvärvats från ECoGs, EMG, hjärna temperatur och rörelseaktivitet. Detaljerade kriterier för att kategorisera djurets beteende i både råttor och möss beskrivs i than-protokollet.
Både råttor och möss måste bedövas med en låg dos av zoletil (25 mg / kg), vilket är hälften av doseringen av bedövningsmedel som normalt administreras under stereotaxisk kirurgi, innan han genomför manuell akupunktur eller EA. Denna dosering medger djur för att vakna upp 30 till 35 min efter injektionen. Antingen manuell akupunktur eller EA utförs vid början av den mörka perioden, med en konstant tidsperiod av 30 min, och varje djur i följd behandlas i två till tre dagar. Stimulerande EA strömmar levereras till en viss acupoint genom en rostfri stål nål som sätts in i acupoint. Stimulansströmmen är ett tåg av bifasiska fyrkantpulser, i vilka pulslängd är 150 ms och stimuleringsintensitet 1 mA. Om en torr nål används för manuell akupunktur, är nålen införd i akupunkturpunkterna ryckte 10 gånger varje 5 min. Den svåraste delen av manuell akupunktur eller EA är att lokalisera akupunkturpunkterna hos gnagare. LOCation av akupunkturpunkter hos råttor eller möss liknar deras anatomiska läge i människor. Till exempel är de bilaterala Fengchi akupunkturpunkter ligger 3 mm bort från den bakre mittlinjen på halsen, mellan de två öron, som liknar den anatomiska läge i människor 11. Vidare kan de akupunkturpunkter med låg impedans på huden ytterligare bekräftas. Simulerad akupunktur eller simulerad EA manipulation är nödvändig för akupunktur eller EA experiment. Simulerad akupunktur eller simulerad EA bör utföras vid en icke-acupoint ligger nära acupoint, såsom nära armhålan 12.
För att framgångsrikt undersöka effekterna av akupunktur eller EA om epilepsi och epilepsi inducerad sömnstörningar, måste följande faktorer vara på plats: en möjlig epileptisk djurmodell, den exakta analysen av epileptiforma ECoGs och återfall av epilepsi, en metod för att klassificera vaksamhet stater och korrekt utförande av akupunktur eller EA i gnagare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att välja en genomförbar epilepsi djurmodell är en förutsättning för varje experimentell ändamål. Ett av våra mål är att belysa effekterna av EA på epilepsi förtryck. EA är en alternativ medicin som kan uppvisa terapeutisk effekt vid epilepsi och har dokumenterats i gammal kinesisk litteratur. Men det finns en brist på vetenskapliga bevis för att bevisa det. För att bestämma effekterna av EA på epilepsi, fokuserade vi främst på effekterna av EA på mild fokal epilepsi, snarare än på svår generali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Ministry of Science and Technology (MOST) grants MOST104-2410-H-002-053 & NSC99-2320-B-002-026-MY3. This manuscript was edited and proofread by Mr. Brian Chang, who has experience revising professional documents.
Materials
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X. Predictors of sleepiness in epilepsy patients. Sleep. 20 (12), 1105-1110 (1997).
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W. Sleep and epilepsy. Semin Neurol. 22, 321-327 (2002).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at ‘Anmian’ (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
