हम विच्छेदित सी में सक्रिय ERK के स्थानिक और लौकिक स्थानीयकरण के लिए एक immunofluorescence इमेजिंग आधारित पद्धति पेश एलिगेंस gonad। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सी में किसी भी सिगनल के दृश्य या संरचनात्मक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता एलिगेंस gonad, बशर्ते एक उपयुक्त एंटीबॉडी अभिकर्मक उपलब्ध है।
Evolutionarily संरक्षित कोशिकी संकेत transducing RTK रास-ERK मार्ग एक महत्वपूर्ण काइनेज-संकेत झरना है कि मुख्य ERK, मार्ग के टर्मिनल काइनेज के सक्रियण के माध्यम से कई सेलुलर और विकास की प्रक्रिया को नियंत्रित करता है। ERK गतिविधि के तंग विनियमन सामान्य विकास और homeostasis के लिए आवश्यक है; अत्यधिक सेलुलर प्रसार में पीढ़ी सक्रिय ERK परिणाम है, जबकि underactive ERK कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। सी एलिगेंस एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है कि मदद की है विकास के दौरान समारोह और RTK रास-ERK संकेतन मार्ग के नियमन के लिए चिह्नित है। विशेष रूप से, RTK रास-ERK मार्ग सी के लिए आवश्यक है germline विकास है, जो इस विधि का ध्यान केंद्रित है एलिगेंस। सक्रिय, ERK (dpERK) की diphosphorylated फार्म के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग, टकसाली स्थानीयकरण पैटर्न germline के भीतर देखे जा सकते हैं। क्योंकि इस पद्धति दोनों स्थानिक और अस्थायी नियंत्रण हैएड, reproducibly की परख के लिए dpERK क्षमता मार्ग है कि dpERK संकेत अवधि और आयाम है और इस तरह germline विकास को प्रभावित के नियामकों की पहचान के लिए उपयोगी है। यहाँ हम कैसे सफलतापूर्वक टुकड़े करना, दाग, और छवि dpERK सी के भीतर प्रदर्शित एलिगेंस gonad। इस विधि सी में किसी भी संकेत के स्थानिक स्थानीयकरण या संरचनात्मक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता एलिगेंस gonad, बशर्ते एक एंटीबॉडी immunofluorescence के साथ संगत उपलब्ध है।
रिसेप्टर tyrosine kinase (RTK) -RAt सारकोमा (रास) -Extracellular संकेत विनियमित kinase (ERK) मार्ग एक संरक्षित काइनेज झरना है कि फोस्फोराइलेशन और ERK 1-3 के सक्रियण में परिणामों के माध्यम से बाह्य संकेत रिले। ERK प्रोटीन संरक्षित प्रोलाइन निर्देशित सेरीन / threonine एमएपी (माइटोजन सक्रिय प्रोटीन) काइनेज परिवार के सदस्य हैं, और सीधे संरक्षित Tey मूल भाव के threonine (टी) और tyrosine (वाई) पर दोहरे फोस्फोराइलेशन के माध्यम से खल्क द्वारा सक्रिय कर रहे हैं। सक्रिय ERK (diphosphorylated ERK, या dpERK के रूप में) फिर नीचे की ओर substrates 1-3 की एक बैटरी की अपनी फोस्फोराइलेशन के माध्यम से कई सेलुलर और विकास की प्रक्रिया को नियंत्रित करता है। इस प्रकार असामान्य गतिविधि ERK कई सेल और विकासात्मक दोष 4-7 की ओर जाता है।
ERK गतिविधि के कड़े नियमन के सामान्य विकास के लिए महत्वपूर्ण है: स्तनधारी प्रणालियों में बहुत ज्यादा ERK गतिविधि अत्यधिक सेलुलर प्रसार अग्रणी करने के लिए सुरागऑन्कोजेनिक विकास के लिए; बहुत कम गतिविधि कोशिका मृत्यु 4,6 की ओर जाता है। 30 मिनट या उससे कम लाती सेल प्रसार, लेकिन ERK सक्रियण 60 मिनट या अधिक लाती neuronal भेदभाव 8,9 के लिए के लिए PC12 कोशिकाओं में, ERK सक्रियण: इसके अतिरिक्त, ERK गतिविधि की अवधि में परिवर्तन भी अलग परिणामों को जन्म दे सकता है। ERK गतिविधि के तंग विनियमन इस प्रकार सामान्य विकास और homeostasis के लिए स्पष्ट रूप से आवश्यक है।
एलिगेंस समारोह और RTK रास-ERK संकेतन मार्ग 3,10-15 के नियमन के टुकड़े करना एक शक्तिशाली, और आनुवंशिक रूप से निंदनीय मॉडल प्रणाली है। स्तनधारी प्रणाली है, जो RAS और ERK, सी के लिए कई जीनों को नियंत्रित करने के सापेक्ष यह प्रतिपादन, जिसमें इस मार्ग 3,10-14 के समारोह टुकड़े करना एक आनुवंशिक रूप से और अधिक सुगम प्रणाली, – एलिगेंस एक आरएएस जीन (जाने-60) और एक ERK जीन (1 MPK) शामिल हैं। सी एलिगेंस germline अनिवार्य रूप से एक ट्यूब कि mitotic के होते हैऔर उसके समीपस्थ अंत (चित्रा 1) के 16 में अपने बाहर अंत में कोशिकाओं को परिपक्व oocytes स्टेम। जनन कोशिकाओं अर्धसूत्रीविभाजन एक विस्तारित meiotic प्रोफेज़ (pachytene), जिसके बाद वे पाश क्षेत्र में oocytes के लिए फार्म, अंत में समीपस्थ क्षेत्र में 16 oocyte परिपक्वता के दौर से गुजर शुरू के माध्यम से प्रगति बाहर का mitotic क्षेत्र के लिए सिर्फ समीपस्थ, और आरंभ करें।
हमारे अपने सहित कई प्रयोगशालाओं, आनुवंशिक अध्ययन से पता चला है कि RTK रास-ERK मार्ग सी में germline विकास के लिए आवश्यक है एलिगेंस 12,13,15,17-19। विशेष रूप से, हम उस ERK नियंत्रण पाया और germline विकास के दौरान कम से कम नौ अलग जैविक प्रक्रियाओं का समन्वय करता है, ऐसे में इस तरह oocyte विकास 11,18 के रूप में जैविक प्रक्रियाओं सेल रोगाणु सेल apoptosis के रूप में विकास स्विच से लेकर। ज्यादातर स्तनधारी सिस्टम, सी में बहुत ज्यादा ERK गतिविधि में की तरह कई छोटे oocytes के उत्पादन में germline परिणाम एलिगेंस, जबकि भी लीएक बड़े oocyte 11 में ttle गतिविधि का परिणाम है। इस प्रकार dpERK की तंग विनियमन सामान्य germline विकास के लिए आवश्यक है। DpERK मध्य pachytene दौरान अधिक है (जोन 1, चित्रा 1), पाश क्षेत्र में कम और उच्च फिर से परिपक्व में: ERK के सक्रिय रूप है, के रूप में विशिष्ट एक एंटीबॉडी dpERK करने द्वारा कल्पना, एक टकसाली, गतिशील, bimodal स्थानीयकरण पैटर्न को प्रदर्शित करता है oocytes (2 जोन, चित्रा 1)। हाल ही में, हमने पाया है कि पोषण जोन 1 12 में ERK सक्रिय करने के लिए इंसुलिन की तरह विकास फैक्टर रिसेप्टर 1 (DAF-2) के माध्यम से कार्य करता है; पहले काम से पता चला है कि शुक्राणु संकेत (Ephrin रिसेप्टर tyrosine काइनेज के माध्यम से) 2 जोन 13 में ERK को सक्रिय करता है।
कि germline में एक रिओस्तात के रूप में सक्रिय ERK कार्यों oocyte विकास, स्थानिक और लौकिक स्थानीयकरण, साथ ही dpERK के आयाम को विनियमित करने के लिए देखते हुए अपने सामान्य सिगनल परिणाम को समझने की कुंजी है। , विधि यहाँ वर्णित का उपयोग में परिवर्तनdpERK के टकसाली स्थानीयकरण आसानी से नजर रखी जा सकती है और भविष्यवाणियों ERK गतिविधि है और इस तरह के समारोह पर पर्यावरण या आनुवंशिक perturbations के प्रभाव पर निकाली गई। इस प्रकार, dpERK के लिए परख करने की क्रिया germline विकास के दौरान अपनी भूमिका के लिए एक व्यापक समझ में सक्षम बनाता है।
सक्रिय ERK (dpERK) सी में एक टकसाली स्थानिक और गतिशील स्थानीयकरण पैटर्न प्रकार एलिगेंस germline। यह टकसाली dpERK स्थानिक पैटर्न (चित्रा 5), और आयाम एक वयस्क सी में एलिगेंस gonad, प्रभावी ढंग से कई जैविक प्रक्रियाओं है कि ERK को नियंत्रित करता है के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक असमर्थता अर्धसूत्रीविभाजन, एक phenotype महिला germlines कि शुक्राणु (चित्रा 5) निर्दिष्ट नहीं करते हैं, और इस तरह परिपक्व oocytes में ERK सक्रिय नहीं करते में मनाया के prophase में जोन में ERK सक्रिय करने के लिए oocytes 2 में परिणाम एक गिरफ्तारी में। महिला germlines 11,13 में 2 जोन में dpERK के प्रभावी संचय, oocyte परिपक्वता और ovulation की शुरुआत के साथ मिलकर में पुरुषों 'परिणामों के साथ संभोग। इस प्रकार स्थानिक पैटर्न और (जैसे कि शाही सेना के हस्तक्षेप मध्यस्थता जीन निष्क्रियता के रूप में) कुछ आनुवंशिक perturbations या रासायनिक उपचार पर dpERK के अस्थायी सक्रियण के विश्लेषण कारक है कि नियमित की पहचान के लिए अनुमति देता हैदेर ERK संकेतन और इस तरह ERK निर्भर जैविक प्रक्रियाओं। इस तरह के विश्लेषण भी संकेत दे रास्ते के बीच उपन्यास आनुवंशिक बातचीत की खोज के लिए सक्षम है।
किसी भी इमेजिंग आधारित विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण टोंटी ऐसे एंटीबॉडी कि आवेदन के लिए विशिष्ट हैं के रूप में कार्य अभिकर्मकों की उपलब्धता है। इस तरह के एक अभिकर्मक तो मौजूद है, तो इस तरह के एक के ऊपर वर्णित के रूप में तरीकों आसानी हित के किसी भी प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण पैटर्न के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। आवेदन इस प्रकार एक कार्य एंटीबॉडी की उपलब्धता द्वारा सीमित है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि विधि एक दिया विकास समय पर विच्छेदन और धुंधला का वर्णन है, यह केवल एक ही समय सीमा में जानकारी का कब्जा सक्षम बनाता है, और गतिशीलता या वास्तविक समय या प्रोटीन कारोबार की दर में प्रोटीन नियमन पर प्रकाश डाला नहीं है।
ऊपर वर्णित विधि फ्रांसिस एट अल से अनुकूलित है। 23 है, जो Seydoux और डन मीटर से अलग हैgonad बाहर निकालना और एंटीबॉडी धुंधला के लिए 24 ethod। विधि फ्रांसिस एट अल पर आधारित है। "निलंबन विधि" और Seydoux और डन विधि की तुलना के लिए "खुर फ्रीज विधि" कहा जाता है बुलाया जाएगा। निलंबन विधि ऐसे dpERK के रूप में संकेतन अणुओं, स्वाभाविक है कि कठोर से निपटने की स्थिति के प्रति संवेदनशील हैं की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थानीयकरण पैटर्न प्राप्त करने के लिए हमारे हाथ में बहुत प्रभावी किया गया है। dpERK स्थानीयकरण के मामले में, हमारे अनुभव में, जोन 1 में संकेत फ्रीज खुर विधि के साथ लगभग undetectable है। इसके अतिरिक्त, नमूना सुखाने, जो अक्सर फ्रीज खुर विधि के साथ हो सकता है, नकली एंटीबॉडी संकेतों में परिणाम है। निलंबन विधि, नमूना सुखाने के बाद से कम से कम gonads प्रक्रिया के दौरान तरल में निलंबित कर दिया है। हम यह भी पाते हैं कि निलंबन विधि एक एकल स्लाइड पर कई अलग जीनोटाइप इमेजिंग के लिए उपयोगी है। उदाहरण के लिए, इस तरह के रूप में दो hermaphrodites जीनोटाइप, तो बनाममहिलाओं सीधे dpERK स्थानीयकरण के लिए की तुलना में, दो जीनोटाइप एक साथ मिलाया जा सकता है करने के लिए जा रहे हैं और संसाधित। यह संभव है क्योंकि phenotypes अलग कर रहे हैं और DAPI morphologies के माध्यम से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। एक ही ट्यूब एक ही स्लाइड पर इमेजिंग द्वारा पीछा में धुंधला अलग जीनोटाइप से gonads के बीच प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, अगर DAPI morphologies अलग पहचाना नहीं कर रहे हैं, तो एक दो कदम एंटीबॉडी धुंधला अपनाया जा सकता है। सबसे पहले प्रत्येक व्यक्ति के जीनोटाइप दो अलग एंटीबॉडी के साथ व्यवहार किया जाता है, उत्परिवर्ती लिए WT और एंटीबॉडी बी के लिए एंटीबॉडी ए (दोनों एंटीबॉडी एक मेजबान dpERK एंटीबॉडी से अलग में उठाए जाने की जरूरत है)। एक बार दो जीनोटाइप प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया है, और धोया, वे एक ट्यूब में एक साथ मिलाया जा सकता है और अब, dpERK एंटीबॉडी के साथ दाग एक माध्यमिक एंटीबॉडी उपचार के बाद ट्यूब में सभी एंटीबॉडी कल्पना करने के लिए। एक क्षमता के लिए एक एकल स्लाइड पर अलग जीनोटाइप तुलना करने के लिए, विशेष रूप से जब डीसक्रियण पैटर्न के eductions किए जा रहे हैं अलग धुंधला की स्थिति से प्रभावित नहीं सटीक व्याख्याओं सुनिश्चित करता है।
जबकि लाभप्रद है, वहाँ निलंबन विधि भर में कई कदम है कि सावधान हेरफेर की आवश्यकता है। यह महत्वपूर्ण है कि विच्छेदन एक समय कुशल तरीके से होते हैं, महत्वपूर्ण बात, विच्छेदन पर 5 मिनट नहीं लेना चाहिए। लंबे समय तक विच्छेदन बार चर dpERK संकेत है, जो अक्सर ERK सक्रियण में विनियमित परिवर्तन, बजाय के रूप में तकनीकी विफलताओं के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती है, में परिणाम। क्योंकि विभिन्न धोने कदम gonads आसानी से pipetting त्रुटियों के कारण ट्यूब से खो दिया जा सकता भर में प्रत्येक विच्छेदन के लिए 150 पशु – यह 100 से अधिक के साथ शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है। कि जोड़ा जा सकता है (जैसे 50 जानवरों प्रत्येक के तीन बैचों के रूप में), या 150 का एक बड़ा बैच विदारक द्वारा gonads की हानि या तो कई छोटे समूहों में विदारक से कम किया जा सकता है एक और चुनौती एक अच्छी तरह से स्थान में झूठ बोलने के लिए gonads हो रही है गठनस्लाइड पर इतना है कि पूरे बाहर का gonad imaged किया जा सकता है। इसे सक्षम करने के लिए, एक माचिस या बाहर gonads अंतरिक्ष के लिए एक खींच लिया पिपेट पर एक बरौनी का उपयोग करें। हालाँकि, ध्यान के रूप में तो इस प्रक्रिया के दौरान gonads को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए। अक्सर इन तकनीकों के साथ यह स्लाइड पर विच्छेदन में महारत हासिल करने के कई प्रयास करने के साथ ही gonads की व्यवस्था लेता है।
एक बार इस तकनीक में महारत हासिल किया गया है, यह विभिन्न जैविक विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली विधि के रूप में कार्य करता है, और सिर्फ dpERK स्तरों की तुलना में अधिक अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए इस विधि सक्रिय p38 स्तर, या सक्रिय CDK स्तर, या किसी भी प्रोटीन जिसके लिए एक एंटीबॉडी अभिकर्मक मौजूद कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, विधि, उपन्यास अवरोधकों या मार्ग के activators के लिए परख करने के लिए पूरे जानवरों में एक रासायनिक निषेध स्क्रीन के साथ मिलकर किया जा सकता dpERK स्तरों के लिए परख करने की क्रिया के माध्यम से। यह दोनों प्रतिक्रिया और किसी भी अवरोधकों कि int सकता है के प्रति संवेदनशीलता का इन विवो readout के लिए अनुमति देगाRTK रास-ERK संकेतन मार्ग के साथ eract। इसके अलावा, इस पद्धति है कि सभी का इस्तेमाल किया जा सकता है और एक ही समय में कल्पना की कई संकेत दे outputs के साथ एंटीबॉडी संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है। कई एंटीबॉडी का उपयोग कई रास्ते हैं, उनके सक्रियण स्थिति के बीच संबंध की अनुमति देता है, और सभी एक ही ऊतक के भीतर परिणाम, इन मुलाकातों की बेहतर समझ के लिए सक्षम करने से। ये सिर्फ इस विधि के आगे अनुप्रयोगों के कुछ ही उदाहरण हैं, लेकिन इस प्रणाली के कई अनुसंधान के हितों का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
Work in the Arur Lab is supported by grants from the National Institutes of Health, NIHGM98200; Cancer Prevention Research Institute of Texas, CPRIT RP160023; the American Cancer Society Research Scholar Award (ACS RSG014-044-DDC); and by the Anna Fuller Funds.
Agarose | Sigma Inc. | A9539 | Dissolve 2 g in 100 ml to make the 2% agarose |
Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass, because dissected gonads often stick to plastic |
25 gauge needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
Syringes (could be 1 or 5 ml) | BD Syringes | 1 ml: BD 309659 | |
Microscope slides (25mm x 75mm x 1.0mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
Coverslips (24x50mm) | Corning | 2935-245 | |
5ml glass conical tube | Corning | 8060-5 | |
9" disposable Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20D | |
Clinical bench top centrifuge | |||
Glass tubes (6x50mm) | Fisherbrand | 14-958-A | |
*M9 solution | |||
Levamisole | Sigma | L9756 | |
3% Paraformaldehyde | Electron microscopy services | 17500 | Obtained as 16% solutions in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer |
**PBS | |||
1X PBST | 1X PBS with 0.1% Tween 20 | ||
Methanol | Electron microscopy services | 18510 | |
Normal goat serum (NGS) | Cell Signaling | 5425 | Diluted to 30% in 1x PBST |
MAPKYT (dpERK) antibody | Sigma Inc. | M9692 | Dilution 1:400 in 30% NGS |
Secondary antibody | Invitrogen | A-11005 | Dilution 1:500 in 30% NGS |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
*M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. | ||
**PBS (1X) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2.2H2O, 0.10 g MgCl2.6H2O, H2O to 1 litre | ||
Nematode Growth Medium (NGM) | 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 minutes. Cool, and add 1 mL of 1M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1M MgSO4 and 25 mL of 1M KPO4. |