Un protocollo per l'utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
Sensibile alla Forza, sensori FRET geneticamente codificati recente sono emersi come uno strumento importante per misurare forze di trazione basati in cellule vive, permettono di approfondire come le forze meccaniche vengono applicate attraverso proteine 1, 2, 3, 4. Con questi strumenti, i ricercatori possono immagine in modo non invasivo le forze intracellulare nelle cellule viventi utilizzano microscopi a fluorescenza convenzionali. Questi sensori sono costituiti da una coppia FRET (proteine fluorescenti donatore e accettore, più frequentemente un donatore e accettore blu giallo) separati da un peptide elastico 3. Contrariamente a C- o codifica N-terminale, questo sensore è inserito in un sito interno di una proteina per misurare la forza meccanica trasmessa attraverso la proteina, comportandosi come un estensimetro molecolare. Aumento della tensione meccanica di tutti i risultati dei sensori in un aumento della distanza tra il FRET-pl'aria, con conseguente diminuzione FRET 3. Come risultato, il FRET è inversamente proporzionale alla forza di trazione.
Questi sensori fluorescenti basati sono stati sviluppati per proteine adesione focale (vinculin 3 e talin 4), proteine del citoscheletro (α-actinina 5), e proteine di giunzione cellula-cellula (E-caderina 6, 7, VE-caderina 8, e PECAM 8). Il linker elastico più utilizzato e ben caratterizzato in questi biosensori è noto come TSmod e consiste in una sequenza ripetitiva di 40 amminoacidi, (GPGGA) 8, che sono stati ottenuti dalla flagelliform proteina seta di ragno. TSmod ha dimostrato di comportarsi come un elastico nano-molla lineare, con FRET reattività per 1 a 5 pN della forza di trazione 3. Diverse lunghezze di flagelliform possono essere utilizzati per modificare la dinamica range di TSmod FRET-forza sensibilità 9. Oltre a flagelliform, spettrina ripete 5 e villin testata peptide (noto come HP35) 4 sono stati usati come i peptidi elastici tra FRET coppie in simili forza biosensori 4. Infine, un recente rapporto ha mostrato che TSmod può anche essere utilizzato per rilevare forze di compressione 10.
Abbiamo recentemente sviluppato un sensore di forza per il linker del nucleo-citoscheletro (LINC) complesso proteico Nesprin2G utilizzando TSmod inserito in una proteina troncata Nesprin2G precedentemente sviluppato noto come mini-Nesprin2G (Figura 2C), che si comporta in modo simile a endogena Nesprin-2G 11. Il complesso LINC contiene più proteine che portano dall'esterno verso l'interno del nucleo, che collega il citoscheletro citoplasmatica alla lamina nucleare. Nesprin-2G è vincolante una proteina strutturale sia allaactina citoscheletro nel citoplasma e alle proteine SUN nello spazio perinucleare. Utilizzando il nostro biosensore, siamo stati in grado di dimostrare che Nesprin-2G è soggetto a tensioni actomiosina-dipendente NIH3T3 fibroblasti 2. Questa è stata la prima volta che la forza è stata misurata direttamente attraverso una proteina nel complesso LINC nucleare, ed è destinato a diventare uno strumento importante per comprendere il ruolo della forza sul nucleo in mechanobiology.
Il protocollo che segue una metodologia dettagliata di come utilizzare il sensore di forza Nesprin-2G, compresa l'espressione del sensore di tensione Nesprin (Nesprin-TS) in cellule di mammifero, nonché l'acquisizione e l'analisi di immagini FRET su cellule che esprimono Nesprin- TS. Utilizzando un microscopio confocale invertito equipaggiato con un rivelatore spettrale, una descrizione di come misurare emissioni sensibilizzate FRET utilizzando unmixing spettrale e di imaging raziometrico FRET è disponibile. Le immagini raziometriche uscita possono essere usati per fare relativa quaconfronti forza ntitative. Mentre questo protocollo è focalizzata sull'espressione di Nesprin-TS in fibroblasti, è facilmente adattabile ad altre cellule di mammifero, entrambe le linee cellulari e cellule primarie. Inoltre, questo protocollo in cui riguarda l'acquisizione delle immagini e analisi FRET può essere facilmente adattato ad altri biosensori forza FRET-based che sono stati sviluppati per altre proteine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Procedimento e dimostrazione di cellule vive di tensione meccanica di tutti Nesprin-2G, una proteina nel complesso LINC nucleare, è stata illustrata sopra. Prima di questo lavoro, varie tecniche, come micropipetta aspirazione, magnetico-tallone citometria, e microscopica laser ablazione, sono stati utilizzati per applicare tensione sul nucleo cellulare e per misurare le proprietà materiali sfusi 16, 17, 18. Tutta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Thomas F. e Kate Miller Jeffress Memoria Trust (a dicembre) e NIH concedere R35GM119617 (a dicembre). Il microscopio confocale di imaging è stata effettuata presso l'impianto di VCU Nanomateriali Caratterizzazione core (NCC).
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
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