ACT-PRESTO (aktiv Klarheit Technik druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in Organe) ermöglicht eine schnelle, effiziente, aber kostengünstige Gewebe Clearing- und schnelle Antikörper das Eindringen in Gewebe gelöscht durch passive Diffusion oder druckunterstützten Lieferung. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Vielzahl von Geweben durch multiple Antikörper gelöscht, immunmarkiert werden und volumen abgebildet.
Die Identifizierung und Erforschung der detaillierten Organisation von Organen oder des ganzen Körpers auf zellulärer Ebene sind grundlegende Herausforderungen in der Biologie. Übergangsverfahren erfordern eine erhebliche Menge an Zeit und Mühe, ein 3D-Bild zu erhalten, und das intakte Gewebe, einschließlich Schneiden, Immunmarkierung, und Abbildungs seriell geschnittene Gewebe, die bei jedem Schritt des Prozesses einen Informationsverlust erzeugt. In jüngster Zeit entwickelten Ansätze für hochauflösende Bildgebung in intaktem Gewebe, molekulare Charakterisierung wurde auf die Markierung von Proteinen beschränkt. Doch derzeit verfügbaren Protokolle für Orgel Clearing erfordern eine beträchtlich lange Prozesszeit, wodurch es schwierig Gewebe Clearing-Techniken im Labor zu implementieren. Wir stellten kürzlich eine schnelle und hoch reproduzierbare Protokoll bezeichnet ACT-PRESTO (a ctive c nungsmäßigkeit t echnique- p ruck r beschwingt e ffizient und s Tabelle t ransfervon Makromolekülen in o rgans), die für die Gewebezwischenraum innerhalb mehrerer Stunden ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht ACT-PRESTO schnelle Immunmarkierung mit konventionellen Methoden und beschleunigt Antikörper das Eindringen in die tiefe Schicht aus dicht gebildeten, dicken Proben durch Druck oder Konvektionsströmung Anwendung. Wir beschreiben, wie Gewebe herzustellen, wie durch Lipidentfernung zu löschen Elektrophorese und wie-Fleck Immuno durch einen druckunterstützten Lieferung. Die Schnelligkeit und Konsistenz des Protokolls wird die Leistung von 3D-histologischen Forschung und volumenbasierte Diagnosen beschleunigen.
Eine der Herausforderungen in den Neurowissenschaften ist die Visualisierung der neuronalen Verdrahtung und einzelne Zellen innerhalb intakten Hirngewebe. Bis vor kurzem demonstriert die Verbindungen zwischen den Neuronen auf diese Weise erforderlich 1) Serienschnitt von Geweben; 2) molekulare Kennzeichnung spezifischer Ziele, wie Axone oder Proteine; und 3) die Visualisierung von 3D – Rekonstruktion des gesamten Gehirns über Rechen Registrierung oder Ausrichtung von 2D – Serienbilder 1. Diese Schritte sind mühsam, erfordert viel Zeit und haften Informationen zu verlieren, während des Schneidens und Kennzeichnung, so dass neuronale Netzwerk-Mapping äußerst schwierig. viele Methoden jedoch, dass für die Visualisierung von intaktem Gewebe ohne Schnitte erlauben entwickelt worden. Biologische Gewebe können durch Gewebe-Clearing – Techniken 2-10 optisch transparent gemacht werden. Eine der wichtigsten Methoden der Brechungsindexunterschiede zwischen dem intakten Gewebe und der Eintauchlösung zu reduzieren, umLichtstreuung im intakten Gewebe zu reduzieren, wodurch das Gewebe transparent zu machen und ermöglicht die Beobachtung von tiefen Strukturen. Einige Arten von Eintauchlösungen hydrophobe Eigenschaften aufweisen, die während des Entwässerungsverfahrens in schnellen Fluoreszenzlöschung führen. Daher sind diese Verfahren nicht mit Fluoreszenzabbildung über einen langen Zeitraum 11,12 kompatibel. Anstelle von hydrophoben Reagenzien verwenden , um andere Methoden hydrophile Reagenzien zur Gewebe Clearing-, wie SeeDB 4 und Sca l e 6, das die Strukturinformation und Fluoreszenz des biologischen Gewebes 4,6,8 aufrechtzuerhalten. Allerdings Makromoleküle, einschließlich Antikörper, kann nicht den Kern des intakten Gewebes durch Diffusion allein erreichen. Daher ist die vorge Markierung von Zielmolekülen in tiefen Bereichen dicht gepackte Gewebe technisch anspruchsvoll.
In einem kürzlich entwickelten Gewebe-Clearing – Verfahren, CLARITY 3, ein Hydrogel eingebettet biologisches Gewebe iS mit Acrylamid gebildet und Lipiden durch Elektrophorese unter Natriumdodecylsulfat (SDS) -haltigen Lösung entfernt werden. Die Probe wird dann in einer Lösung mit einem passenden Brechungsindex Licht 3 Streuung reduzieren getaucht. Die Lipidentfernungssystem wurde später in fortgeschrittenen CLARITY 13 und PACT (passive Klarheit Technik) 10 modifiziert. Nach der Polymerisation vernetzen acrylamid Ketten mit Proteinen, hydrogel-bildenden Gewebe. Lipidkomponenten mit Acrylamid nicht vernetzen können; Somit Lipide können durch Elektrophorese unter dem SDS-enthaltenden Puffer eliminiert werden. Durch die aktive Eliminierung von Lipiden, Hirngewebe deutlich erhöht Transparenz 9. Allerdings sind diese Methoden nicht die Unmöglichkeit, tief Kennzeichnung durch freie Diffusion adressieren. Um diese Einschränkung zu, Techniken für den aktiven Transport von Reagenzien in die tiefsten Teile der dicken Gewebe zu überwinden sind erforderlich.
Obwohl ermöglicht CLARITY Gewebe Clearing- und TiefengewebsmassageVisualisierung, es ist keine einfache oder schnelle Prozedur. Es kann mehrere Wochen dauern , eine ganze Mäusegehirn 7,14 zu löschen. Schnelle Abwicklung von Gewebe ist wesentlich für die Anwendung solcher Methoden auf der Grundlagen- oder klinischen Labor-Einstellungen für Life-Science-Forschung oder Volumen Diagnose. Das aktuelle Protokoll sieht ein vereinfachtes Verfahren zur biologischen Gewebe Freigabe und nachfolgende Proteinnachweis durch druckunterstützten Lieferung Immunfärbung. Es ist geeignet für hochauflösende Abbildungsvolumen großer abgelegt und 3D-Datenverarbeitungssysteme durch Kombination mit bildgebenden Verfahren.
Schlechte Fixierung oder Hydrogel Eintauchen in das Gewebe kann den Verlust von Proteinen führen und die Verzerrung des Gewebes während des Gewebes Clearing-Prozess. Die ganze erwachsenen Gehirn der Maus sollte über Nacht in 4% Paraformaldehyd inkubiert werden, gefolgt von Eintauchen in einem minimalen Volumen von 20 ml Hydrogel Monomerlösung für 12 bis 18 h unter leichtem Schütteln. Für große Gewebe einschließlich menschliches Gewebe wie Gehirn und Rückenmark slices verlängerte Zeit in dem Hydrogel Monomerlösung Einweichen erforderlich. Das ACT-Protokoll ist leicht anwendbar für das Clearing von fixierten Gewebe, weil die Gewebefixierung und Polymerinfusionsschritte getrennt sind. Nach Gewebe Lichtung wurden menschliche Gewebe mit mehreren Antikörpern gut gefärbt. Beachten Sie, dass die ACT Verrechnungsverfahren mit Alkohol Fixiermitteln, wie Ethanol und Methanol nicht kompatibel ist.
Das Gewebe-Hydrogel-Polymerisationsschritt ist auch wichtig, gute Qualität Gewebe nach dem Clearing-Verfahren herzustellen. weilSauerstoff inhibiert die Polymerisation von Acrylamid, sollte es durch Entgasen des Gewebe enthaltenden Lösung unter einem Stickstoffgasinfusionssystem entfernt werden. Alternativ kann De-Sauerstoffversorgung für 23 h mit einer Vakuumkammer unter Verwendung von mit einem Wärmeblock ausgeführt werden.
Die Clearing – Rate hängt von zahlreichen Faktoren ab , einschließlich der Organgröße, die Inhalte von Lipiden oder ECM Faserproteine, den Zustand der Fixierung, usw. Die meisten erwachsenen Mausgeweben kann über Nacht durch ETC gelöscht werden. Es besteht jedoch die Gefahr einer unnötigen Über Clearing- und Gewebe Schwellung; Somit sind die Unterschiede in der Klärungszeit von wichtiger Gesichtspunkt. Tissue-Clearing-Bedingungen sollten empirisch ermittelt werden. Wichtig ist, dass der Inhalt der ECM kann das Aussehen des Gewebes beeinträchtigen gelöscht. Die Farbe des Gewebes bleibt weiß oder opak, selbst nach dem ACT in ETC-Puffer, da ACT nicht dichten Proteinfasern löschen. Wenn jedoch wurden diese Organe in RI passende Lösung eingetaucht, diey wurde durchsichtig.
Die Rate der Gewebeschwellung erscheint auf den ECM Inhalte der Gewebe und weiche Organe, wie das Gehirn, weisen ein höheres Quellverhältnis als dichte Organe abhängig. Da erhöhte Gewebe nutzt ACT Schwellung wird das Gewebe-Clearing-Verfahren helfen, routinemäßig auf Wasserbasis Puffer in den meisten Fällen destilliert. In einigen Fällen, wenn Gewebeschwellung oder transient Deformierung nicht erwünscht ist, wie beispielsweise in Embryonen, Puffer, enthaltend 0,1X PBS für hochauflösende Bildgebung angewendet werden. Es sollte auch bemerkt werden, dass höhere Salzkonzentrationen in dem Puffer die Schrumpfung des Gewebes verursachen könnten.
Die ACT – Methode können ganze Organe zu klären und auch den ganzen Körper einer Maus 14. Allerdings erfordert tiefen Gewebe-Bildgebung von transparenten Gewebe speziellen Mikroskopen und Ziele. Somit Hirngewebe 1- bis 2 mm dick ist am effektivsten für die Bildgebung mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop. In unseren Händen, das Entfernen des Etikettsed Antikörper aus ACT-verarbeitete Gewebe ist die Antikörper-abhängige und Runden von verschiedenen Antikörpermarkierung sind nicht zu empfehlen. Mehrere Antikörper, wie TH und GFAP arbeitete besonders gut für die Ganzhirnimmunmarkierung 14. Auf der anderen Seite können einige Antikörper, wie TuJ1 oder Map2, oft nur die Oberfläche der Gewebe gekennzeichnet. Dies kann durch andere Verfahren verbessert werden, wie beispielsweise Schalter 15. Eine weitere potenzielle Einschränkung ist, dass es schwierig sein könnte, feine Proteinstrukturen in ACT-verarbeitete Gewebe zu erhalten, weil das Gewebe Schwellung und Schrumpfung während des Gewebe-Löschschritt.
Presto-Technik ist auf eine breite Vielfalt von Gewebemarkierungstechniken. Beispielsweise in gewebe transparent Methoden vormarkiert Gewebe, wie SeeDB 4 und iDISCO 7, Immunmarkierung von dichtem Gewebe erfordert Inkubationszeiten länger als mehrere Tage bis Wochen. Allerdings PRESTO kann die Inkubationszeit bis zu mehreren Stunden zu verkürzen, enabling die Fertigstellung des gesamten Prozesses innerhalb eines Tages mit 1 mm dicken dichten Gewebe. PRESTO kann die Wirksamkeit von tief Kennzeichnung dicken, dichten Gewebe oder sogar un-geklärt dicke Gewebe verbessern. Weil PRESTO eine Tischzentrifuge oder Spritzenpumpe verwendet und erfordert keine spezielle Ausrüstung, ist es relativ einfach, diese Technik mit Routinelaborverfahren zu implementieren.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
Collagen type Ⅳ | Abcam | AB6586 | Antibody/immunolabeling |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies – Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
Syringe (20 ml) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S20 | s-PRESTO |
3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |