High-density Elektro-Aankoop in een knaagdier Model met behulp van goedkope en Open-source Resources

Summary

Instructions for the low-cost construction and surgical implantation of a chronic transcranial high-density electroencephalographic montage into mice are provided. Signal recording, extraction, and processing techniques are also described.

Abstract

Geavanceerde elektro-analysetechnieken die een hoge ruimtelijke resolutie, met inbegrip van elektrische bron beeldvorming en maatregelen van netwerkconnectiviteit, zijn van toepassing op een groeiende verscheidenheid van vragen in de neurowetenschappen. Het uitvoeren van dit soort analyses in een knaagdier model vereist een hogere elektrode dichtheid dan de traditionele schroef elektroden kunnen volbrengen. Terwijl hogere dichtheid elektro montages voor knaagdieren bestaan, zijn beperkte beschikbaarheid meeste onderzoekers niet robuust genoeg voor herhaaldelijk experimenten gedurende langere tijd, of zijn beperkt tot gebruik in verdoofde knaagdieren. ^1-3 Een voorgesteld goedkope werkwijze voor het construeren van een duurzame, aftellen transcraniële elektrode-reeks, bestaande uit bilateraal implanteerbare hoofddeksels wordt onderzocht als een middel om het specifiekere elektro analyses bij muizen of ratten.

Procedures voor het hoofddeksel fabricage en chirurgische implantatie nODIG hoge signaal-ruis te produceren, lage impedantie elektro en elektromyografische signalen worden gepresenteerd. Terwijl de methode nuttig bij ratten en muizen, dit manuscript staat de meer uitdagende uitvoering voor de kleinere muis schedel. Vrij bewegende muizen worden alleen vastgebonden aan kabels via een gemeenschappelijke adapter tijdens het opnemen. Eén versie van deze elektrode systeem 26 elektro-kanalen en 4 electromyografische kanalen bevat wordt hieronder beschreven.

Introduction

Neuronale activiteit kan extracellulair worden opgenomen met verschillende niveaus van granulariteit van microscopische (individuele actiepotentialen) naar Mesoscopische (lokale veld potentials) naar macroscopische (elektro-encefalogram). Deze hersengolven sporen klassiek geanalyseerd in het frequentiedomein te karakteriseren gedrags-, neurofysiologische of elektrofysiologische staten. Dit kan gedaan worden met een enkele biopotential, ⁴ maar spaarzaam dichtheid EEG-registraties kan de ruimtelijke component van neuronale activiteit niet op te lossen. Moderne elektro-analyse is gebaseerd op meerdere elektroden om gedetailleerde kaarten van spatiotemporele verdeling van de corticale activiteit produceren om die activiteit specifieke psychologische aandoeningen en fysiologische processen te correleren. ^5-7 Twee van de meest gebruikte categorieën van de analyse die een hoge dichtheid EEG montages zijn elektrische bron beeldvorming en neurale netwerk connectiviteit maatregelen. ^8-11

<p class="jove_content"> Elektrische bron beeldvorming betreft de lokalisatie van functioneel actieve hersengebieden. Topografische kaart brengen van de elektrode-reeks kan de huidige bron dichtheid van de elektrische activiteit in de hersenen te visualiseren tijdens event related potentials (ERP) en evoked potentials (EPs). Elektrische bronlokalisatie wordt vaak gebruikt in zowel inbeslagname studies alsook in stroomverdeling analyses. ^12-15 Sinds EEG heeft een hoge tijdsresolutie, EEG-onderzoek mogelijk te maken real-time evaluatie van ERP's en EP's, alsmede tijdelijk precieze post hoc analyse. ^{3,11 , 12}

Associëren cognitieve staten en functies met het samenspel van oscillaties te zien op het elektro-encefalogram is het uiteindelijke doel van de verschillende maatregelen van neurale netwerk connectiviteit. Talrijke studies hebben aangetoond synchronisatie en fase vergrendeling van oscillaties tussen verschillende hersengebieden worden geassocieerd met specifieke toestanden van prikkeling, aandacht en actie. ^{6,13,14,16-19} </sup> Het aantonen van een dergelijk signaal associaties tussen hersengebieden vereist high-density arrays dat de beoordeling van de netwerkverbinding mogelijk te maken.

Bronlokalisatie en netwerkanalyses van EEG-signalen afkomstig van studies bij mensen, maar onderzoek naar de neurale basis voor deze signalen altijd tot diermodellen mocht invasieve technieken die anders onmogelijk bij mensen vereisen. Om deze analyses in knaagdiermodellen repliceren, is een werkwijze voor het opnemen van hoge dichtheid EEG-signalen in de hersenen van een knaagdier nodig. Terwijl andere groepen high-density micro-elektrode arrays zijn geconstrueerd voor gebruik bij muizen, dergelijke benaderingen zijn beperkt beschikbaar voor onderzoekers zonder toegang tot nanoproductievoorzieningen, niet robuust genoeg voor herhaaldelijk experimenten gedurende langere tijd, of zijn beperkt tot gebruik in geanesthetiseerde muizen. ^1-3,7 Een goedkoop alternatief protocol voor het construeren van een chronische hoge dichtheid, transcraniële elektrode array wordt hier gedemonstreerd.

Het signaal acquisitie benadering hier beschreven is niet beperkt tot EEG, maar omvat elektromyografische (EMG) signalen. Verwerving van EMG signalen kan een aanvullende benadering voor het definiëren van het gedrag toestand en is bijzonder nuttig voor slaapstudies. Deze benadering verschaft een intermediair tussen dure, ultra-high-density intracraniale rasters en het beperkte aantal mogelijke lead traditionele schroef elektroden die onvoldoende voor geavanceerde analyse benaderingen. Het kopstuk ontwerp wordt gemakkelijk geconstrueerd en betaalbaar voor high-throughput studies. Het gebruik van deze acquisitie systeem in combinatie met diverse genetische of farmacologische manipulatieve technieken binnen knaagdieren modellen kunnen helpen ontdekken van de mechanismen van de corticale oscillatie generatie, gedrags- afwijkingen van ware genotypische verschillen, bron lokalisatie van ERP's en EP's, en grootschalige netwerkcommunicatie.

Protocol

De studies uitgevoerd in dit onderzoek waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren en door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Pennsylvania goedgekeurd. 1. hoofddeksel Bouw Verwijder elke achtste rij pennen van de 2 x 50 pin baksteen van een 100 positie ontvangverbindingsstuk met een pincet door op de opnamegedeelte van de pen door de bouwsteen van kunststof. Opmerking: Pins naar beneden is de stand die zal worden verwezen voor de rest van het protocol zijn. (Let op dit specifiek in 2.6). Bedek de pinnen met een zeer dun laagje nagellak te isoleren en laat de nagellak volledig drogen. Verwijder de nagellak van de uiteinden van de pennen met aceton en een kleine doek. Snijd het overtollige plastic van de 2 x 7 met behulp van een scheermesje of wire-cutting pliers. Dit zal resulteren in 2 x 7 stenen die geïsoleerd zijn langs de lengte van de pennen en blootgesteld aan de pin tip. Deze zullen uiteindelijk de transcraniële EEG-elektroden. Twee 2 x 7 bouwstenen nodig voor een volledige chronische elektrodenmatrix (Figuur 1A). Snij twee 1 x 2-pins steen voor EMG signaal opname. Gebruik hetzelfde proces van het verwijderen van ongewenste pinnen met een pincet en snijden van de overtollige plastic weg naar de 1 x 2 bakstenen te maken. Zorg ervoor dat deze 1 x 2 hebben een gladde kant om hen van de oorspronkelijke 100 Position Houder als deze afstand de standaard pin afstand voor elk hoofddeksel zal worden, zodat een enkele adapter zal werken voor alle hoofddeksels (Figuur 1A). Gebruik 2-componenten epoxy om de 1 x 2-pins stuk hechten aan de 2 x 7-polige stuk (figuur 1D). Aangezien beide pennen moeten in dezelfde richting, de epoxy 1 x 2 aan de zijkant van beide helften van het hoofdstuk met de gladde zijde van de 1 x 2 en 2 x7 met elkaar in contact. Lijn de 1 x 2 gaatjes en pinnen met het achterste meest 2 rijen pinnen op de 2 x 7. Opmerking: De twee helften van de helm niet aan elkaar epoxy. Dit zorgt voor flexibiliteit in de twee helften van de zendspoel adapter voor gemakkelijkere verbinding tijdens gewenning en gedurende experimentele dagen (figuur 1E). Laat de helm helften genezen 's nachts. Na voltooiing, het hoofddeksel is bilateraal symmetrisch. Elke helft bestaat uit een 2 x 7-polige baksteen met een zijdelings verbonden 2 x 1 pin steen die in lijn is met het achterste hoogste 2 rijen van de 2 x 7-polige baksteen. Bereid draden voor EMG signaal opname. Enkelstrengs, is 31 G-perfluoralkoxy geïsoleerde zilverdraad gebruikt voor EMG signaal opname (figuur 1D). Echter, meerdere draden of andere metalen bedrading kan desgewenst worden vervangen. Voor het maken van thoracale EMG draden neem een ​​3,0 cm lang stuk perfluoralkoxy geïsoleerde zilverdraad en remove 1 cm van de kunststof isolatie van het ene uiteinde met een scheermesje. Wikkel de ongeïsoleerde draad rond een pincet tweemaal. Verwijder de draad van de pincet en verwijder 25 mm van isolatie aan de niet lusvormige einde met een scheermesje. Om cervicale EMG draden te construeren, herhaal het proces met een 1,5 cm segment van de draad. Twee cervicale EMG draden en twee thoracale EMG draden nodig zijn voor een volledige hoofddeksel. Verwijder de zijdelingse pin in de verste voorste rij beide hoofddeksels, wat overeenkomt met een stereotaxische coördinaten van 3,3 mm anterior van Bregma en 2,3 mm lateraal van Bregma, omdat er geen hersenen onder deze locatie bepaald door een muis hersenatlas 20 (figuur 2A). Op beide hoofddeksel helften, snijd de pennen van 1 x 2 brick de plastic basis van het hoofddeksel met een kniptang (3,0 mm van de punt van de pen) en soldeer de cervicale EMG draad naar de voorste pen en de thoracale EMG naar de achterste pin. Controleer of elke pen is elektrisch geïsoleerd. Voer een test continuïteit met een digitale multimeter door de twee draden van de voltmeter verschillende pennen terwijl de continuïteitsmodus. Elektrisch zal geïsoleerde pinnen niet een geluidssignaal met deze multimeter te veroorzaken; echter elektrisch gekoppeld pinnen. Bedek de soldeerverbindingen met nagellak en eenmaal droog, buig de EMG draden zodanig dat zij parallel aan de voorste / achterste as met minimale laterale verplaatsing. Trim kunnen een relatieve lengte zodat ze overeenkomen met het oppervlakteprofiel van de hersenen. Met de assistent van een muis hersenen atlas, opnemen ventrale afstand tot de hersenen oppervlak van Bregma voor elke pen te coördineren. 20 De pen waarvan ventrale afstand van Bregma is de grootste zal als indicator voor pin trimmen dienen. Deze pin zal niet worden bijgesneden terwijl alle andere pinnen met respect zal worden gesneden om deze maximale ventrale afstand pin (tabel 1). Opmerking: Pins kan naar maat worden geslepen, maar het moet zorgvuldig gebeuren aangezien de wrijving tussen pen en slijpschijf kan de pinnen van het hoofddeksel te buigen. Als er een pin gebogen is, gebruik een pincet om het rechtzetten. Een alternatief voor het slijpen van de pennen naar lengte hen bekleding met een paar draad kniptang. Betrekking hebben op alle van de pen tips met een zilveren oplossing met behulp van een zilveren oplossing pen en laten drogen. Deze stap verlaagt elektrode impedantie om ≤30 kQ, die de signaal-ruisverhouding toeneemt en tegelijkertijd elimineert de ruwe randen veroorzaakt door pin trimmen derhalve afnemende kans op weefselbeschadiging en versnelt het herstel na een operatie. Een afgeronde hoofddeksel half gewicht van ongeveer 0,5 g. 2. Adapter Bouw en Channel Mapping Snijd de verbindingsgeleiders van een 36 positie twee rijen mannelijke Nano-miniatuur-naar-gelijke lengte van 2 of 3 cm met een scheermesje. Voor elke draad, strip off 2.5 mm van de isolatie van het einde en tin de blootgestelde metaal voor elke draad. Zorg ervoor dat wanneer vertinnen om een ​​enkele, dunne draad van ingeblikte draad hebben voor elk nano-adapter draad omdat dit van cruciaal belang is om pinnen te isoleren. Knip de gestripte isolatie met-wire kniptang (figuur 1C). Maak een bijpassende male / male connector aan het hoofddeksel met de Conn Strip Header 2 x 50. Cut twee 2 x 7's en twee 2 x 1's van een 2 x 50 baksteen. Verwijder ongewenste pinnen van de 2 x 50 steen voor het afbreken van een van de mannelijke pennen en duw de ongebroken tweede helft van hetzelfde stuk van de connector met een pincet (Figuur 1B). Opmerking: Een zijde van deze kunnen dienen als adapter kunnen worden aangesloten op elke kopstuk, terwijl de andere helft zal worden gesoldeerd aan de geconserveerde verbindingsgeleiders nano. Zorg ervoor dat de platte plastic randen van de 2 x 1 en 2 x 7 ontroerend hebben om de juiste paring van de man / man connector garanderen door het hoofddeksel gemaakt in stap1. Soldeer op één van de grond / verwijzing draden van de nano aan op de gewenste ondergrond / referentiepen. Grond en referentie-draden zijn samengebonden op de RHD2132 versterker chip. Gebruik de enkele pin, dat is 0,60 mm anterior tot Bregma en 1,00 mm lateraal van Bregma als zowel de hand en op de grond. (Links hoofddeksel, mediale pin van de derde voorste rij, maar een andere pen kan worden toegewezen indien gewenst, figuur 2) Merk op dat het mogelijk is om gemalen en vindplaats scheiden van de versterker chip door het verwijderen van de 0Ω weerstand die grond stropdassen en vindplaats samen als het isoleren van de twee gewenst. Soldeer de vertinde nano-connector aan dezelfde kant van de man / male connectoren als de grond / referentie-pins aansluiting. Elke draad is gekoppeld aan een specifiek kanaal, zodat channel setup op dit moment kan worden afgerond. Channel kaart diagrammen voor de versterker headstages zijn te vinden op de Open Ephys Wiki website (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Soldeer de overeenkomstige draad waarvan kanaal waarover de respectievelijke pin om de gewenste afbeelding te bereiken. Knip ongebruikte draden aan de voet van de nano-connector met de draad snijden tang. Gebruik een voltmeter om ervoor te zorgen dat elke pen is elektrisch geïsoleerd van andere pinnen. Zodra isolatie wordt bevestigd, breng dan een dun laagje nagellak rond elke solderen is om elke pen verder te isoleren. Met behulp van 2-componenten epoxy, versterken de bijpassende nano-adapter op de bilaterale 2 x 7 en 2 x 1 pinnen op de man-man bakstenen. Let op: Er zullen twee helften om deze single adapter die overeenkomen met de pen-configuratie van de kopstuk helften eerder hebt gemaakt. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de mediale deel van elk de helft van de adapter overtollige epoxy overlopen de plastic rand van de man / man-aansluiting heeft, omdat dit zal voorkomen dat beide helften van het hoofddeksel wordt aangesloten tegelijkertijd. Laat geen epoxy te stromen naar de onderkant van de pin adapter portie van de adapter, omdat dit zou ook voorkomen dat de juiste aansluitingen. Gebruik de 2 helften hoofddeksel als een mal voor een goede aansluiting pin uitlijning. Epoxy beide helften van de adapter en epoxy de basis van de nano connector om de duurzaamheid te verhogen. Zorg ervoor dat alle soldeerverbindingen bedekken met epoxy. Laat de adapter cure 's nachts. Bevestiging van juiste kanaal mapping kan worden uitgevoerd met impedantiemetingen in het groen-Ephys grafische gebruikersinterface (GUI). Een afgeronde adapter weegt ongeveer 1,3 g (Figuur 1F). 3. Chirurgie Bereid een steriele chirurgische veld. Draag steriele handschoenen en andere persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals vereist. Steriliseren instrumenten in een autoclaaf. Steriliseer het stereotactische frame met een 1,0 mM chloordioxide-oplossing. Spuit de oplossing op het frame en wacht 5 minuten voor het spoelen met steriel water. Om implanteerbare headp steriliserenIECE onderdelen, spuit de onderdelen met een 1,0 mM chloordioxide-oplossing, en wacht 5 minuten voor het spoelen met steriel water. Plaats de nu steriele implanteerbare hardware in een steriele petrischaal. Zorg voor een pre-operatieve gewicht voor de muis, dan verdoven de muis in een 200 ml inductie kamer met behulp van 1,5-2,0% isofluraan in 100% zuurstof. Gebruik een debiet in de kamer van ongeveer 500 ml / min. Bevestig meer verlies van evenwicht door het draaien van de inductie kamer. Verwijder de muis uit de inductie kamer en de plaats in de neuskegel van de stereotactische kader, zonder volledig te beveiligen van het hoofd van de muis met het oor bars. Blijven controleren op de juiste diepte van de anesthesie door teen knijpen evaluatie, terwijl ook de beoordeling van de vitale functies. Handhaaf de lichaamstemperatuur op 37 ° C met een gesloten temperatuurregelaar, zoals een rectale sonde en verwarmingskussen systeem. Bedek de ogen van de muis met oogheelkundige oogzalf voor het trimmen van de vachtop de bovenkant van de schedel via gebogen schaar of tondeuse. Ontsmet het hoofd met betadine en laat de betadine volledig drogen voordat u verder gaat. Beheren pijnstillers en antibiotica met vloeistoffen intraperitoneaal. Voor een 25 g muis, 0,5 mg cefazoline, 0,125 mg meloxicam, 0,5 ml zoutoplossing en 2,5 ug buprenorfine q 4-6 uur prn. Injecteer 250 ui 0,25% bupivacaïne subcutaan langs middellijn op het hoofd, en injecteer 100 ul 0,25% bupivacaïne subcutaan aan beide jukbeenbogen van de muis. Zet de muis in het stereotaxische frame en bloot de schedel. Zet de kop van de muis met de stereotaxische oor bars aan de stereotaxische frame. Controleer of de muis is een chirurgische vlak van anesthesie door bevestiging van de afwezigheid van de teen knijpen reflex. Maak een 1,5-2,0 cm incisie samen met een No. 11 wegwerpbistouri langs middellijn van de schedel. De incisie start van tussen de ogen en verder posterieur aan het achterhoofd. </ Li> Expose de schedel door het verspreiden van de huid lateraal met micro klemmen. Verminder isofluraan concentratie van 2,0% tot een concentratie die een chirurgische vlak van anesthesie onderhoudt, maar niet terug te brengen tot minder dan 1,0% isofluraan in 100% zuurstof. Pre-operatieve analgesie vermindert de hoeveelheid geïnhaleerde verdoving nodig is om een ​​chirurgische diepte van de anesthesie te handhaven, en kan leiden tot een sneller herstel en verbeterde overleving resultaten. Niveau van de schedel en boor braam gaten. Identificeer Bregma en nul de stereotactische coördinaten van Bregma, waarbij de oorsprong van het coördinatensysteem wordt. De schedel niveau in de mediale / laterale as bewegen nivellering sonde 1,50 mm lateraal bevestigd aan een stereotaxische manipulator arm in beide richtingen van Bregma en bevestigen dat de dorsale / ventrale diepte minder dan 0,05 mm wanneer de sonde contact maakt met de linker en rechter zijden van de schedel. Opmerking: De 10 micrometer resolutie van de dorsale / ventrale manipulator arm gebruikt in combinatie met een digitale coördinaat vertoning vereenvoudigt nivellering. Nivelleren van de voorste / achterste as over Bregma volgt dezelfde techniek. Het verschil in de ventrale afstand voor het contact Bregma en Lamda ook kleiner zijn dan 0,05 mm. Stel de schedel tot nivellering volledig in beide richtingen zodat het dwarsvlak evenwijdig aan de grond is. Dit maakt ware stereotactische coördinaten zoals in muizenhersenen atlas. 20 Met een 0,5 mm diameter micro boor in een stereotaxische zagen, boren boorgaten van 3,30 mm tot 4,50 mm anterior naar posterior Bregma in stappen van 1,30 mm bij 1,00 mm lateraal aan de middellijn op beide helften van de schedel. Voor de 2,30 mm zijdelingse kolommen elektroden, boor boorgaten van 2,00 mm anterior tot bregma tot 4,50 mm achter Bregma in stappen van 1,30 mm aan beide zijden van de middellijn (figuur 2). De hoge nauwkeurigheid en precisie die vereist is voor deze Dr.Doden bewerking wordt vereenvoudigd door de 10 urn resolutie van een digitale stereotaxische manipulator arm. Opmerking: Om de pennen van de kopstuk goed worden ingeplant, moet de schedel van de muis stevig op zijn plaats binnen het stereotactische frame. Als de schedel tijdens het boren beweegt, kan foutieve uitlijning van het hoofddeksel en braam gaten ontstaan. Implanteer het hoofddeksels. Met rechte tang, bereiden EMG draad tunnels voor de thoracale EMG draden. Hol 2,5 cm tussen de huid en spieren in de rug voor zowel de linker en rechter EMG draden. Steek de borst- en baarmoederhalskanker EMG in de holte gemaakt met de rechte tang, en dan manoeuvreren de EEG baksteen met gebogen pincet zodanig dat de pennen uit te lijnen met de eerder geboorde gaten braam. Oefen lichte druk op het hoofddeksel en wiebelen de pennen in de schedel. Pin diameter 0,46 mm. Met isolerende nagellak, zal de pinnen strak in het geboorde braam holes. Het hoofddeksel zal stabiel zijn als het eenmaal op de juiste wijze is geplaatst. Pas EMG draden aan eindposities. Doe hetzelfde voor de zendspoel op de andere zijde. Zet de helm op zijn plaats met behulp van tandheelkundige cement. Wanneer beide hoofddeksels wordt ondernomen, meng 1: 1 verhouding van methylmethacrylaat met een verknopende verbinding. Breng het mengsel zodanig dat het betrekking heeft op de blootgestelde schedel, nagel gepolijste delen van de pin elektroden en proximale gedeelte van EMG draden, maar heeft geen betrekking op de vrouwelijke houders van het hoofddeksel. Zorg ervoor dat cement niet op bont. Staan geen ribbels cement te vormen dat de muis kunnen grijpen op zal zijn. Zorg voor voldoende tijd voor het cement te drogen, en verwijder vervolgens de muis uit de stereotactische frame. Het totale gewicht dat de muis zal moeten uitvoeren is vanaf de 2 helften van het kopstuk en het vastzetten cement is ongeveer 1,2 g. Plaats het dier in een schonerecovery omgeving. Handhaaf kerntemperatuur van het lichaam met een verwarmingselement. Bewaken van de muis totdat het herwint alle houdingsreflexen, betekenende opkomst van anesthesie. Individuele huisvesting wordt aanbevolen voor herstel op lange termijn. Dagelijkse opvolging voor een minimum van 3 dagen na de operatie wordt aanbevolen bij interventionele pijnstilling. Laat 10-14 dagen van herstel na de operatie voordat u een tethered gewenningsperiode. 4. wennen Animals to Tethering Sluit de adapter aan op de muis met behulp van een muis hoofdsteun (figuur 1G-H). Vasthouden tegenovergestelde hoeken van de hoofddeksels die op zijn plaats gecementeerd met gebogen hemostats wanneer de muis wordt tegengehouden vast en plaats de adapter pennen in de geïmplanteerde zendspoel op beide zijden. Sluit de 32 kanaals versterker aan op de adapter (Figuur 1H). Zorg ervoor dat de logo's op zowel de adapter en de versterker af te stemmen in een consistent oriëntatie voor zowel de adapter als de versterker aan channel-mapping fouten te voorkomen. Sluit de versterker aan op een RHD2000 standaard seriële perifere interface (SPI) kabel. Deze kabel maakt verbinding met de acquisitie systeem voor het vastleggen van signalen. Plaats de muis in een kamer die een vrijdragende arm op de kamerwand geïnstalleerd. Bevestig de SPI interfacekabel op de cantileverarm en pas de spanning in de cantileverarm het gewicht van de kabel tegen gebonden. De muis is vrij kunnen bewegen en is gewend voor een uur per dag van de week voor de opname. Om de muis los te koppelen, eenvoudig de kabel en de adapter van de muis haalt u tijdens het gebruik van een platte roestvrijstalen micro spatel om te helpen bij het loskoppelen van de adapter uit de muis. 5. Signal Extraction System Setup / Signal Recording Steek de geconstrueerde adapter in het hoofddeksel van een geïmplanteerde muis. Sluit een headstage versterker aan op de adapter enhechten een standaard SPI-interface kabel om de versterker en de acquisitie board. Hebben de SPI-kabel aansluit op een correct gespannen cantilever, zodat het extra gewicht op het hoofd van de muis wordt geminimaliseerd. Plaats een lokale kooi van Faraday, gemaakt met het uitvoeren van gaas of aluminiumfolie, rond de headstage en aard de lokale kooi van Faraday. Verkrijgen elektrode impedanties voor het begin van iedere opname door eenvoudig een 30 kS / sec bemonsteringssnelheid en meten impedantie via de module in de GUI. Een impedantie waarde minder dan of gelijk aan 10 kQ voor een individuele PIN is nodig voor bevestiging van juiste elektrodecontact. Hogere impedantie waarden resulteren in verwierp gegevens van die elektrode. Voor het opnemen, het creëren van een signaal keten van Rhythm FPGA, bandfilter en LFP kijker in de GUI. Het wordt aanbevolen om een ​​sampling rate van 1,00 kS / s, bandbreedte van 0.1-7,500 Hz selecteren en schakel DSP. Stel de Bandpass filter om 0,1-250 Hz en de kanalen op te gevenking van de LFP-viewer. 250 en 400 mV kanaal amplitudes met draw werkwijze gekozen best visualiseert de gegevens. Beginnen met het opnemen met behulp van de GUI. Maak een nieuwe map voor elke opname en het pad voor het opslaan van bestanden naar die map. Om een ​​opname te starten gewoon hit. Alle 32 kanalen van de connector worden geregistreerd door standaard, maar ongewenste kanalen worden gedeselecteerd door op de rechterkant van de Rhythm FPGA-module voor het begin van de opname. Invoer van gegevens in Matlab voor analyse. Er zijn een groot aantal open source toolboxen die kunnen worden gebruikt als hulpmiddel bij de analyse.

Representative Results

Voorbeeldgegevens die in een vrij bewegende muis geïmplanteerd met een hoge dichtheid EEG kopstuk wordt getoond in figuur 3. Onafhankelijke EEG-golfvormen corresponderen met de kanaal-mapping systeem getoond in figuur 2. Voorbeelden van cervicale en thoracale EMG worden getoond in figuur 3. Merk op dat de thoracale EMG opname bevat ook verankerd elektrische activiteit uit het hart van de muis dat is direct duidelijk wanneer een verschilsignaal tussen de twee thoracale EMG draden (T) wordt berekend. Deze opname is het ook mogelijk om de muis hartslag berekenen door de tijd tussen elektrocardiografische QRS pieken meten. 23-24 Evenzo is het mogelijk ademhalingsfrequentie de muis te meten door het berekenen driefase variabiliteit van de QRS spike de borstholte uit en contracten met elke ademhaling. 25 Vandaar dat deze setup vergunningen voor overname of muizen polysomnografie. Bovendien maakt de opstelling corticale mapping visueel opgewekte potentialen (afbeelding 4). Wanneer een 10 msec lichtpuls alleen linkeroog van de muis wordt geleverd, worden klassieke reacties geregistreerd in de contralaterale (niet ipsilaterale) primaire visuele cortex die worden gevolgd door een vertraagde reactie in contralaterale secundaire visuele cortex. De film ingebed in figuur 4 toont de tijd variërende elektrische potentialen over de gehele corticale oppervlak met grafieken van activiteit contralaterale V1 en V2. AP 3.3 0 0 2 0.4 0.6 0.6 0.4 </td> 0.7 0.6 0.9 0.9 0.6 -0,6 0.9 1 1 0.9 -1,9 1 1.1 1.1 1 -3,2 3 1 1 1 1 3 -4,5 3 0.7 0.7 0.7 0.7 3 ML -2,3 -1 1 2.3 Tabel 1:. Pin Trimmen Lengths Deze figuur toont de benodigde trimmen lengtes, in mm, per pin voor het hoofddeksel. Lengtes voor pin trimmen werden uit een muizenhersenen atlas verworven. After trimmen pinnen, het hoofdstuk overeenkomt met het oppervlakteprofiel van de hersenen. 20 EMG kunnen volledig afgesneden gebruikte EMG signaal op te nemen draden zijn gesoldeerd op de pen stub. Figuur 1:. Hoofddeksel Components, Intermediate Bouw Steps, en de juiste aansluiting voor het opnemen Deze figuur toont de grondstof voor hoofddeksels te maken. Beginnend met een 100-pins connector houder, worden kleiner 2 x 7 en 2 x 1 componenten gemaakt. Merk op dat in de 2 x 1 component, de oorspronkelijke rand van de 2 x 50 intact, die in overeenstemming hoofddeksel constructie maakt en zorgt voor een adapter voor verbinding met een groot aantal geïmplanteerde muizen. Figuur 1B en 1C ruwe materialen bij de adapter creëren presenteren van het hoofddeksel aan de versterker. 1B presenteert het hoofddeksel einde vande adapter die op dezelfde wijze wordt gekapt om verbinding te maken met het hoofddeksel. Merk op dat die 2 x 1 heeft weer een oorspronkelijke rand van de ruwe componenten, zorgen voor een goede verbinding tussen de adapter en het hoofddeksel. Figuur 1C toont het einde van de adapter die wordt aangesloten op de versterker. Figuur 1D illustreert de epoxy 2 x 7 en 2 x 1 componenten samen met voorbereide EMG draden voor signaal opnemen. Figuur 1E toont een voltooide hoofddeksel. Figuur 1F toont een voltooide adapter. Figuur 1G toont een verband tussen de hoofddeksels en de adapter. Ten slotte Figuur 1 H toont een geïmplanteerde muis met aangesloten adapter en versterker. De versterker chip is verbonden met een interface kabel die loopt naar de acquisitie board (niet getoond). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <pclass > Figuur 2:. Elektrode Montage en Volledig Gebouwd hoofddeksel Deze figuur toont plaatsing van elektroden met betrekking tot de hersenen van muizen. Elektrodenlocaties zijn gebaseerd op stereotaxische coördinaten van Bregma. Coördinaten voor elke elektrode kan worden gevonden in stap 4.8 van het protocol. Elektrode kleur overeenkomt met de onderliggende hersengebieden voor elke elektrode. Wit = frontale associatie cortex (FRA), Orange = primaire motorische cortex (M1), Pink = secundaire motorische cortex (M2), Dark Green = primaire somatosensorische cortex, voorpoot regio (S1FL), Groen = primaire somatosensorische cortex, dysgranular zone (S1DZ ) Lichtgroen = primaire somatosensorische cortex, vat veld (S1BF), Geel = mediale pariëtale vereniging cortex (MPTA), Dark Blue = primaire visuele cortex (V1), Light Blue = secundaire visuele cortex, mediomedial gebied (V2MM), Zwart = retrospleniale dysgranular cortex (RSD). 20 Common Reference / Ground wordt ook getoond. Deze referentie regeling minimaliseert de luchtwegen artefact binnen het ruwe signaal. Nummers van de afzonderlijke elektrode te kanaalfolder voor de gehele array. Afbeelding gewijzigd ten opzichte van Allen Mouse Brain Atlas. 21,22 Figuur 2B toont een volledig gebouwd hoofddeksel op schaal met betrekking tot een dubbeltje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Voorbeeld van EEG en EMG Sporen uit de elektrode Montage elektrode golfvormen komen overeen met het kanaal mapping weergegeven in figuur 1A.. Cervicale EMG (C) biedt de mogelijkheid om nuchal spierspanning (+) te bepalen. EMG signalen bevatten ook cardiale QRS elektrische impulsen(*). Schaal bars van 200 mV voor trace amplitude en 1 sec voor de duur trace worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: ruimtelijke verdeling van Visual evoked potential ruimtelijke verdeling van de evoked potential aanleiding van een verzoek van een eenzijdige lichtflits alleen toegediend aan het linkeroog.. Bovenste diagram toont de hoge dichtheid EEG montage waarbij elke cirkel, die een elektrode. Kleurverandering tijd overeen met veranderingen in de tijd voor iedere respectieve elektrode spanning. Op tijd = 0 msec, wordt een 10 msec lichtpuls geleverd en vertegenwoordigde in het midden figuur. Bottom afbeelding toont betekenen evoked potential sporen voor contralaterale V1 en V2 EEG-elektroden (n = 108 EP trials). Light pulse treedt op 0 msec. Merk op dat de overeenkomstige evoked potential reactie wordt waargenomen in contralaterale V1 (zwart trace), gevolgd door een langere latency evoked potential respons in contralaterale V2 (rood trace). (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Discussion

De voordelige constructie en chirurgische stappen nodig om een ​​26 kanaal, high-density EEG montage in een muis goed te bereiken wordt beschreven. Juiste epidurale elektrode contact is cruciaal nemen kwaliteitsvolle EEG-signalen in dit systeem. Twee stappen binnen het IP-adres van dit probleem: speld in orde maken van de hersenen contour, en hoofddeksel implantatie voorafgaand aan acryl versterking aan te passen. Het is belangrijk om een ​​pin te kort tijdens de bouwfase niet te snijden. Bij het implanteren van de hoofddeksels, is het noodzakelijk om pin plaatsing te controleren voordat de definitieve acryl versterking. Een manier om de juiste elektrode contact te bevestigen is door middel van impedantie testen. Ogenschijnlijk, impedantie van 5-10 kOhm suggereren juiste epidurale plaatsing. ²⁶   Impedantiemetingen tonen de duurzaamheid hoofddeksels, zoals elektrode impedantiewaarden stabiel op deze 5-10 kQ bereik voor ten minste 4 maanden na implantatie. De andereessentiële stap omvat het uitlijnen van de EMG pennen met de twee meest naar de rijen 2 x 7 EEG baksteen. Dit is essentieel voor adapterverbinding, zoals uitgelijnd EMG en EEG kunnen leiden tot een onvermogen om de adapter of gebogen adapter te kunnen verbinden.

Een groot voordeel van dit meetsysteem is het gemak van het wijzigen van de vorm van de elektrode-reeks teneinde uiteenlopende behoeften experimentele optimaliseren. Aangepast Elektrodevoorzieningen die optimaal geschikt zijn voor specifieke experimenten gemakkelijk worden gemaakt. Voorbeeld specifieke experimenten zou kunnen combineren EEG met canule voor gerichte geneesmiddelafgifte voor gecombineerde farmacologische electroencephalographic en gedragsonderzoek. ²⁷ Zendspoelen, adapters en chirurgische procedures worden gemakkelijk aangepast aan een groot aantal studies bij het volgen van de werkwijze beschreven in het protocol bovengenoemde werkwijzen . Een tweede grote voordeel van deze acquisitie systeem is de lage kosten. Op dit moment is deze acquisitie systeem kanverslag 128 input kanalen op maximaal 4 afzonderlijke kabels, waardoor gelijktijdige opnamen van 4 muizen of, indien gewenst, ratten met een hogere dichtheid grids. Een dergelijke uitbreiding zou slechts vereisen extra kabels en adapters.

Deze benadering high-density EEG acquisitie richt nadelen van andere high-density EEG acquisitiemethoden bij muizen. De in dit werk beschreven systeem handig gebouwd met eenvoudige materialen en gebruikt open source hardware en software die is goedkoop en stabiel maakt herhaalde metingen in hetzelfde dier gedurende maanden, maakt vrije beweging tijdens een experiment, en geen muizen eisen dat verdoofd voor opname. Beperkingen van dit systeem is dat het alleen gevalideerd tot op heden in muizen die 20 g of meer weegt en die ouder dan 12 weken. Kleinere of jongere muizen kunnen moeite hebben met het hoofddeksel implantatie hebben. Een tweede beperking van deze methode is het onvermogen nauwkeurig stuurelektrode diepte na headpIECE fabricage. Echter, dezelfde beperking geldt voor traditionele schroef EEG-elektroden, aangezien er geen manier exact de pre-mortem inschroefdiepte opzichte van het corticale oppervlak. Problemen oplossen voor deze methode meestal omvat de juiste afscherming interfererende signaal van de muis wanneer vastgebonden om ruisvrije signaal te verkrijgen.

High-density EEG arrays zijn essentieel voor de complexe spatiotemporele analyse van EEG gegevens die de nieuwe normale moderne EEG interpretatie zijn. Terwijl de ruimtelijke verdeling van een visuele evoked potential wordt geïllustreerd, kunnen de gegevens verkregen met behulp van dit systeem worden geanalyseerd met behulp van elektrische bron beeldvormende technieken en neuronale connectiviteit maatregelen. Een 60% tot 70% vermindering van contact tussen deze elektroden kunnen dan traditionele schroefcontacten maakt nauwkeuriger localisatie signaal, zie figuur 4. Gebruikmakend high-density analytische technieken in genetisch gemodificeerde muizen na Pharmacological interventie, of bij dieren met een intrinsieke pathologie zoals epilepsie kan helpen onderscheiden van de mechanismen genereren van specifieke corticale oscillaties, lokaliseren van bronnen van de ERP's en EP's, en onthullen grootschalig netwerk eigenschappen. Door betere parallel schakelen menselijke systemen, zal deze aanpak te verbeteren kleine dierlijke modellen van menselijke neurofysiologie en neuropathologie, waardoor makkelijker vertaling van ontdekkingen gedaan in diermodellen aan de wetenschappelijke en klinische relevantie bij de mens.

Materials

32 Channel RHD2132 amplifier headstage	Intan Technologies	C3314
Aquistion Board	Open Ephys	v2.2
100 Position Receptable Connector	Digi-Key	ED85100-ND	Headpiece
Acetone (1L)	Sigma Aldrich	179973-1L
Razor Blade (100pack)	McMaster Carr	3962A4
Wire-Cutting Pliers	MSC Industrial	321786
2-Part Epoxy	McMaster Carr	7605A18
PFA Coated Silver Wire (25ft)	A-M Systems	787000	EMG Wire
CircuitWriter Pen	MCM Electronics	200-175	Silver Applicator for Electrode Tips
36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector	Omnetics Connector Corporation	A79028-001	Headpiece to Amplifier Adapter
Conn Strip Header 2 x 50	Digi-Key	ED83100-ND	Headpiece to Amplifier Adapter
Clidox Base and Acitvator	Pharmacal	95120F & 96120F	Sterilant
Isoflurane	Priamal Enterprises Ltd	66794-019-10
Oxygen	Airgas	OX USP300
Closed Loop Temperature Controller	CWE Inc.	08-130000
Curved Scissors	FST	14085-09
0.25% Bupivicaine Hydrochloride	Hospira	0409-1159-02	Local Anesthetic
Meloxicam 5mg/mL	Henry Schein	6451602845	Pain/Inflammation Relief
0.9% Sodium Chloride	Hospira	0409-4888-20	Fluids
Cefazolin	Hospira	0409-0806-01	Antibacterial
No.11 Disposable Scapel (20 pk)	Feather	2975#11
Micro Serrefines	FST	18052-3
Cotton Swabs (1000 pk)	MSC Industrial	8749574
0.5mm Micro Drill Bit	FST	19007-05
Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1471
Curved Forceps	Roboz	RS-5136
Methyl Methacrylate	A-M Systems	525000	Cement for headpiece
Methyl Methacrylate Crosslinking Compound	A-M Systems	526000
Curved Hemostats	FST	13003-10	Aide in Adapter Connection
RHD2000 standard SPI interface cable (3ft)	Intan Technologies	C3203
Cantilever Arm	Instech	MCLA
Micro Spatula (12 pk)	Fischer Scientific	S50822
Digital Soldering Station	MCM Electronics	21-10115
Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead	MCM Electronics	21-1045
Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based)	L.A. Colors	CNP508
Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Kopf	Model 940