2 डी और 3 डी मैट्रिसिस के लिए रैखिक invadosome गठन और गतिविधि अध्ययन
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि कैसे 2 डी मिश्रित मैट्रिक्स तैयार करने के लिए, जिलेटिन और कोलेजन I से मिलकर, और एक 3D कोलेजन मैं रैखिक invadosomes का अध्ययन करने के लिए प्लग। ये प्रोटोकॉल रैखिक आविष्कारक गठन, मैट्रिक्स गिरावट गतिविधि, और प्राथमिक कोशिकाओं और कैंसर सेल लाइनों के आक्रमण क्षमताओं के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं।
Abstract
सेल आसंजन, प्रवास, और आक्रमण कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में शामिल हैं I उदाहरण के लिए, मेटास्टेसिस के गठन के दौरान, ट्यूमर कोशिकाओं को रक्त या लसीकाय वाहिकाओं तक पहुंचने के लिए आसपास के ऊतकों पर आक्रमण करने और आबाद करने के लिए संरचनात्मक अवरोधों को पार करना पड़ता है। इसके लिए कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के बीच बातचीत की आवश्यकता है। सेलुलर स्तर पर, कैंसर कोशिकाओं के बहुमत वाले कई कोशिकाएं, इनडॉडोसोम बनाने में सक्षम हैं, जो एफ-एक्टिन-आधारित ढांचे जो अपमानजनक ईसीएम में सक्षम हैं। इनडॉडोसोम एक्टिविंस एक्टिन संरचनाएं हैं जो मैट्रिक्स मेटलॉप्रोटीनसेस (एमएमपी) को भर्ती और सक्रिय करते हैं। आणविक संरचना, घनत्व, संगठन, और ईसीएम की कठोरता आजादी के गठन और सक्रियण को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है। इन विट्रो में , एक जिलटिन परख एक मानक परख है जो इनडोस्कोम डिग्रेडेशन गतिविधि का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करता है। हालांकि, जिलेटिन, जो विकृत कोलाजेन I है, एक शारीरिक मैट्रिक्स ई नहीं हैlement। टाइप आई कोलेजन तंतुओं का उपयोग करते हुए एक उपन्यास परख विकसित किया गया था और यह प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता था कि यह शारीरिक मैट्रिक्स इनडॉडोसोमों का एक शक्तिशाली उद्यमी है। कोलेजन तंतुओं के साथ मिलकर काम करने वाले इनकोडोसोम को फाइबर पर उनके रैखिक संगठन के कारण रैखिक invadosomes के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, रैखिक invadosomes के आणविक विश्लेषण से पता चला है कि डिस्कोइडिन डोमेन रिसेप्टर 1 (DDR1) उनके गठन में शामिल रिसेप्टर है। कोशिकाओं और ईसीएम के बीच जटिल बातचीत को समझने के लिए ये आंकड़े स्पष्ट रूप से शारीरिक रूप से प्रासंगिक मैट्रिक्स का उपयोग करने के महत्व को दर्शाते हैं।
Introduction
एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) रीमॉडेलिंग शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं के दौरान होता है, जैसे एंजियोजेनेसिस और ट्यूमर सेल आक्रमण शारीरिक परिस्थितियों में, कई सेल प्रकार, जो कि हेमटोपोएटिक वंश से अधिकतर, ईसीएम तत्वों को विघटित करने में सक्षम हैं। उदाहरण के लिए, मैक्रोफेज ऊतकों तक पहुंचने के लिए संरचनात्मक बाधाओं को पार करने में सक्षम हैं, और ऑस्टियोक्लास्ट कैल्शियम होमोस्टैसिस को सुनिश्चित करने के लिए हड्डी मैट्रिक्स को नीचा कर देते हैं। अधिक विश्व स्तर पर, शरीर में सभी मैट्रिक्स अपने भौतिक और रासायनिक गुणों को बनाए रखने के लिए नवीनीकृत करते हैं। कैंसर के ऊतकों में, ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट संरचना बदल जाती है। उदाहरण के लिए, स्तन और फेफड़ों के कैंसर में, टाइप करें मैं कोलेजन को अत्यधिक विषम और ट्यूमर के आसपास जम जाता है। इसके अलावा, यह संचय मेटास्टेसिस 1 , 2 के विकास के जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है। कैंसर मेटास्टैसिस कैंसर कोशिकाओं की क्षमता पर ईसीएम नीचा और आसन्न ऊतकों पर आक्रमण पर निर्भर है।
कोशिकाओं की आक्रामक गतिविधि विशिष्ट एक्टिन-समृद्ध संरचनाओं को जिम्मेदार ठहराती है जिसे आविंदोसोम नाम से जाना जाता है। इस अवधि में सामान्यतः और कैंसर कोशिकाओं ( जैसे, मैक्रोफेज, एंडोथेलियल कोशिकाएं, और एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर सेल लाइन जैसे कैंसर कोशिकाओं ) में क्रमशः पॉडोसोम और ऐनाडोडोपोडिया शामिल हैं। इन विट्रो में , इनकोडोसोम विभिन्न आकारों में व्यवस्थित कर सकते हैं: डॉट्स, समुच्चय या रोज 3 शास्त्रीय रूप से, इनडेडोसोम एक एफ-एक्टिन कोर से बने होते हैं जिनमें कई प्रोटीन होते हैं, जैसे स्कैफोल्ड प्रोटीन टीके 5 और कॉरटेक्टिन, जो आसंजन पट्टिका के अणुओं से घिरा हुआ है, जैसे कि इंटीग्रिन और वििनकुलिन 4 । हाल ही में, यह दिखाया गया था कि Tks5 और RhoGTPase सीडीसी 42 को कार्यात्मक invadosomes 5 के लिए कम से कम आणविक हस्ताक्षर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये संरचनाएं विशिष्ट मेटलॉप्रोटेस प्रोटीन की भर्ती और सक्रियण के माध्यम से ईसीएम को नीचा दिखाने में सक्षम हैं, जैसे कि एमटी 1-एमएमपी और एमएमपी -2 6। पिछले अध्ययन में, हमने बताया कि टाइप 1 कोलेजन तंतुओं और डिस्कोइडन डोमेन रिसेप्टर 1 (डीडीआर 1) के बीच बातचीत, टाइप आई कोलेजन तंतुओं के एक विशिष्ट रिसेप्टर, रैखिक invadosomes नामक एक नए वर्ग invadosomes के गठन की ओर जाता है। रैखिक invadosomes प्रकार मैं कोलेजन तंतुओं के साथ 7 का गठन कर रहे हैं ये संरचनाएं एमटी 1-एमएमपी / एमएमपी 2 की भर्ती और सक्रियण के माध्यम से प्रकार मैं कोलेजन तंतुओं को नीचा कर सकती हैं। इसके अलावा, उनका गठन Tks5 और Cdc42 5 पर निर्भर है। इन विट्रो में , हमने विभिन्न मैट्रिक्स तत्वों के संयोजन से विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करके रैखिक invadosomes और उनके गठन और गतिविधि 8 में DDR1 की उपस्थिति का प्रदर्शन किया, जिनमें निम्न शामिल हैं: i) फ्लोरोसेंट जेलाटीन-लेपित शॉस्लिप्स, ii) फ्लोरोसेंट टाइप मैं कोलेजन फाब्रिल -क्लाइड कवरलेट्स, और iii) 3 डी प्रकार मैं कोलेजन प्लग। विभिन्न मैट्रिक्स के उपयोग के कारण, हम अध्ययन और चरित्र के लिए सक्षम थेरैखिक आविष्कारक गठन और उनकी गिरावट गतिविधि 7 , 8
आखिरकार, आक्रामक कोशिकाओं के जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने के लिए, ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट संरचना की जटिलता की नकल करते हुए, 2 डी और 3 डी संस्कृति दोनों प्रणालियों में ईसीएम घटकों के संयोजन का उपयोग किया गया। नीचे 2 डी और 3 डी कल्चर सिस्टम में जिलेटिन / टाइप आई कोलेजन के साथ कवर लेटेप के लिए प्रोटोकॉल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्लासिकल, इनकोडोसोम का प्रयोग माइक्रोएनेयरमेंट और मैट्रिक्स के संबंध में इन विट्रो में किया जाता है, जिस पर कोशिका चढ़ायी जाती हैं। वर्तमान में कई प्रकार के मैट्रिक्स का उपयोग किया जाता है, जिस…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जेडीएम को INSERM / क्षेत्र एक्विटेन से पीएचडी फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था और अब एक पोस्ट-डॉक्टरेट एआरसी फेलोशिप और माउंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडीसिन में Tisch कैंसर इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित है। ईएच को पीएचडी द्वारा समर्थित है मिनिस्टेरे डी ल एन एनिसिमेंट सुपरएरीयर एट डे ला रिकेर। एसजीईई एजेंस नेशनेल डी ला रिकशे (एएनआर) से पोस्ट डॉक्टरेट फेलोशिप द्वारा समर्थित है। मुख्यमंत्री को माईंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडिसिन में Tisch कैंसर इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित है और जे जे बी सी एनआईएच / एनसीआई अनुदान K22CA196750, टीसीआई यंग साइंटिस्ट कैंसर रिसर्च अवार्ड जेजेआरआर फंड और माउंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडीसिन में Tisch कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित है। यह काम ANR-13-JJC-JSV1-0005 से अनुदान द्वारा समर्थित था। एफएस "लीग नेशनलली कॉन्ट्रे ले कैंसर" द्वारा समर्थित है। वीएम और एफएस "इक्ूइप लेबेलिसि लीग नेशनेल कॉन्ट्रै ले कैंसर 2016" और इन्स्टिट्यूट नेशनल डु कैंसर, इंकै_8036, और पीएलबीओ2012 से फंडिंग द्वारा समर्थित हैं।
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
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