2D- og 3D-matriser for å studere lineær invadosomdannelse og aktivitet
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du skal lage en 2D blandet matrise, bestående av gelatin og kollagen I, og en 3D kollagen I-plugg for å studere lineære invadosomer. Disse protokollene tillater studier av lineær invadosomdannelse, matriksdegradasjonsaktivitet og invasjonsegenskapene til primære celler og kreftcellelinjer.
Abstract
Celleadhesjon, migrasjon og invasjon er involvert i mange fysiologiske og patologiske prosesser. For eksempel, under metastaseformasjon, må tumorceller krysse anatomiske barrierer for å invadere og migrere gjennom det omkringliggende vevet for å nå blod eller lymfatiske kar. Dette krever samspillet mellom celler og den ekstracellulære matriksen (ECM). På mobilnivå kan mange celler, inkludert de fleste kreftceller, danne invadosomer, som er F-aktinbaserte strukturer som er i stand til å nedbryte ECM. Invadosomer er fremspringende aktinstrukturer som rekrutterer og aktiverer matrise metalloproteinaser (MMPs). Den molekylære sammensetning, tetthet, organisering og stivhet av ECM er avgjørende for regulering av invadosomdannelse og aktivering. In vitro er en gelatinestudie standardanalysen som brukes til å observere og kvantifisere invadosomedbrytningsaktivitet. Gelatin, som er denaturert kollagen I, er imidlertid ikke en fysiologisk matrise element. En ny analyse med bruk av type I kollagenfibriller ble utviklet og brukt til å demonstrere at denne fysiologiske matrisen er en potent induktor av invadosomer. Invadosomer som danner langs kollagenfibriller er kjent som lineære invadosomer på grunn av deres lineære organisering på fibrene. Videre viste molekylær analyse av lineære invadosomer at discoidin-domene-reseptoren 1 (DDR1) er reseptoren involvert i deres dannelse. Disse dataene viser tydelig viktigheten av å bruke en fysiologisk relevant matrise for å forstå de komplekse interaksjonene mellom celler og ECM.
Introduction
Ekstracellulær matrise (ECM) remodeling oppstår under fysiologiske og patologiske prosesser, som angiogenese og tumorcelle invasjon. I fysiologiske forhold kan mange celletyper, hovedsakelig fra hematopoietisk stamme, nedbryte ECM-elementer. For eksempel er makrofager i stand til å krysse anatomiske barrierer for å nå vev, og osteoklaster nedbryter beinmatrise for å sikre kalsiumhemostase. Mer globalt, forny alle matriser i kroppen for å opprettholde sine fysiske og kjemiske egenskaper. I kreftvev endres tumormikromiljøsammensetningen. For eksempel i bryst- og lungekreft er type I kollagen overuttrukket og akkumuleres rundt svulsten. Videre er denne akkumuleringen forbundet med økt risiko for utvikling av metastase 1 , 2 . Kreftmetastase er avhengig av kreftcellernes evne til å nedbryte ECM og invadere tilstøtende vev.
DeInvasiv aktivitet av celler tilskrives spesialiserte aktinrike strukturer kjent som invadosomer. Dette begrepet omfatter podosomer og invadopodier, som er til stede i henholdsvis normale og kreftceller ( f.eks. Makrofager, endotelceller og kreftceller som MDA-MB-231 brystkreftcellelinjen). In vitro kan invadosomer organisere i forskjellige former: prikker, aggregater eller rosettes 3 . Klassisk er invadosomer sammensatt av en F-aktinkjerne som inneholder flere proteiner, slik som stillasproteinet Tks5 og cortactin, omgitt av adhesjonsplakkmolekyler, så som integriner og vinculin 4 . Nylig ble det vist at Tks5 og RhoGTPase Cdc42 kan brukes som en minimumsmolekylær signatur for funksjonelle invadosomer 5 . Disse strukturene er i stand til å nedbryte ECM via rekruttering og aktivering av spesifikke metalloprotease proteiner, som MT1-MMP og MMP-2 6. I en tidligere studie rapporterte vi at samspillet mellom type I kollagenfibriller og discoidin domene receptor 1 (DDR1), en spesifikk reseptor av type I kollagenfibriller, fører til dannelsen av en ny klasse invadosomer, kalt lineære invadosomer. Lineære invadosomer dannes langs type I kollagenfibriller 7 . Disse strukturene er i stand til å nedbryte type I kollagenfibriller via rekruttering og aktivering av MT1-MMP / MMP2. Videre er deres dannelse avhengig av Tks5 og Cdc42 5 . In vitro demonstrerte vi eksistensen av lineære invadosomer og involvering av DDR1 i deres dannelse og aktivitet 8 ved hjelp av forskjellige strategier bestående av en kombinasjon av forskjellige matrikselementer, inkludert: i) fluorescerende gelatinebelagte dekklister, ii) fluorescerende type I kollagenfibril -belagte dekselglass, og iii) 3D type I kollagenplugger. På grunn av bruken av forskjellige matriser, var vi i stand til å studere og karakterereIze lineær invadosomdannelse og deres nedbrytningsaktivitet 7 , 8 .
Til slutt, for bedre å forstå biologien til invasive celler, ble en kombinasjon av ECM-komponenter i begge 2D- og 3D-kultursystemer brukt, etterlikner kompleksiteten av tumormikro-miljø-sammensetningen. Nedenfor er protokoller for beleggbelegg med gelatin / type I kollagen i 2D- og 3D-kultursystemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klassisk undersøkes invadosomer in vitro uten hensyn til mikromiljøet og matrisen som cellene er plettert på. Flere typer matriser brukes for tiden, inkludert gelatin, fibronektin, vitronektin eller høytetthetsfibrillerkollagen (HDFC) 7 , 11 ; Imidlertid er disse ofte ikke representative for mikromiljøet der celler ligger og ikke er fysiologisk relevante. Her ble en ny type matriks, som består av en sammenheng mellom kollagen av gelatin og fibrill…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JDM ble støttet av et PhD-fellesskap fra INSERM / Région Aquitaine, og støttes nå av et postdoktoralt ARC-fellesskap og Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine. EH støttes av en PhD fra Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE støttes av et postdoktoralt fellesskap fra Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM støttes av Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine og JJBC støttes av NIH / NCI-stipend K22CA196750, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fond, og Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine. Dette arbeidet ble støttet av et tilskud fra ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS støttes av "Ligue nationale contre le cancer". VM og FS støttes av finansiering fra "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" og Institut National du Cancer, INCA_8036 og PLBio2012.
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
