套筒技术在主动脉移植小鼠模型中的应用-教学视频

Summary

本文采用套筒技术对小鼠原位主动脉移植模型进行了研究。它是一种非常快速的吻合方法, 可用于血管疾病的研究。

Abstract

采用袖套技术的原位主动脉移植可减少10-20% 的失败率, 降低主动脉的损伤。使用套筒法吻合小鼠主动脉的时间较短, 易于平均20分钟, 允许对同种异体移植进行研究。下面的文章介绍了主动脉移植术在我们的实验室中的应用。小鼠用1.5% 容积异氟醚和100% 氧气的混合物在面罩中麻醉。此时, 肾动脉与其分支之间的动脉段与腔静脉分离, 自由制备, clampedat 近端和远端段, 单丝缝合。在主动脉切除之前, 将含肝素的盐水溶液注入下腔静脉。然后在钳夹之间切断主动脉, 用生理盐水肝素溶液冲洗腔内。采用单丝缝合袖套技术, 在原位移植腹主动脉。

Introduction

正如先前的一项研究指出的, 对小鼠主动脉移植模型给予了极大的关注, 这种模式允许在移植物本身引起的特定血管反应和与 arteriogenic 环境有关的某些系统因素之间进行区分。^1,2,3. 在这里扮演关键角色的主要因素是淘汰赛和转基因小鼠的可用性。他们参与这种模式提供了确定和确定新的病理生理学途径的可能性与发展的退行性血管疾病, 如动脉粥样硬化和动脉瘤形成^4,5。

值得注意的是, 在移植过程中, 血管内的缺血/再灌注损伤可能会出现。因此, 在术后期间发生的具体问题与移植完整性或意想不到的炎症反应不能排除可能解除退行性血管疾病的病理生理改变^{3 ,4,5,6,7}。套管吻合是一种替代的 end-in-end 方法, 用于动脉吻合直径小于一毫米的血管, 并已成功应用于大鼠的肾和心脏移植, 随后适应主动脉小鼠移植的 Dambrin et al.^8,9,10,11。

主动脉损伤使用袖状移植技术是最小的, 技术故障率非常低, 由于它只持续20分钟平均。我们以前的研究结果表明, 在移植使用套筒技术¹后, isograft在体内具有优异的功能和结构特性。Dambrin et al.描述在短学习曲线之后, 成功率超过 78%¹⁰。并发症, 如血栓形成是罕见的, 例如 Engelbrecht et al.没有观察到血栓形成使用套筒技术在肾移植在大鼠⁸。

小鼠主动脉移植模型与套筒吻合是一种快速、简便的研究同种异体移植血管反应的工具。这段视频说明了在我们实验室进行的主动脉移植手术。这种移植模型可能有助于确定血管退行性疾病的潜在病理机制, 并可能有助于进一步评价分子和药理干预措施¹²。

Protocol

涉及动物的程序由 RWTH 亚琛大学的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准, AZ 84-02.04.2012. A234. 注意: 使用 CD1 背景的成年雄性野鼠演示了该过程。在手术前后将小鼠放在一个专门的实验室里, 确保适当地获得食物、专门的兽医控制和治疗。如果这些动物是从外面买来的, 在做手术前允许一周的驯化. 1. 捐赠者的准备 使用无菌材料和器械在手术期间保持无菌状态以避免感染. 麻醉每只老鼠用1.5% 的混合异氟醚和100% 氧气通过口罩。将鼠标放在仰卧位的平台上, 并将其所有的腿粘在手术台上。通过捏后腿来检查其反射, 以确保鼠标足够麻醉。将眼部药膏放在眼部, 以防在手术过程中干燥. 用脱毛凝胶或剃须刀从腹部取出所有毛发。在无菌条件下进行操作。用洗必泰和无菌水交替擦洗腹部消毒. 通过带剪刀或手术刀的中线腹切口移除供体主动脉。将肠道手动缩回右侧。用无粉手套轻轻地将肠道反射到一侧. 将肠道放在一块用盐水浸湿的纱布上, 以保持其湿润. 用镊子将腹主动脉从周围组织中仔细解剖. 用镊子将大动脉之间的动脉段与腔静脉分叉分开. 使用11-0 单丝单线缝合, 确保此段的所有小分支都非常小心. 在移除主动脉之前, 将含 50 U 肝素的盐水溶液注入0.5 毫升 (毫升) 到下腔静脉. 让供体动物血在主动脉段后被移除. 将移植物完全用盐水冲洗干净, 然后立即将其转移到 ice-cold 盐水的容器中. 2。准备收件人 麻醉1.5% 的混合体, 由异氟醚和100% 氧气通过面罩, 然后删除头发和消毒 (1 节) 的受体动物。用手术刀将中线切开, 从剑到骨盆, 并缩回腹壁。将眼部药膏放在眼部上, 防止在手术过程中出现干燥. 在盐水溶液中用湿纱布包裹肠道, 并轻轻地移到动物和 #39; 右. 解剖下主动脉游离于肾动脉下部与镊子远端分岔之间. 使用11-0 单丝单线缝合, 确保此段的所有小分支都非常小心. 用6-0 单丝缝合钳夹住主动脉的近端和远端部分. 在夹钳中间划分主动脉, 用素盐水冲洗切口末端, 使管腔张开. 将移植物放在原位, 将喂食容器端插入接收容器, 然后用11-0 单丝进行缝合, 以避免主动脉的任何扭转, 适当地对准施主和接受者 ( 图 1 ) 10 . 在对吻合进行检查后, 仔细地松开绷带。先松开远端钳。这导致在释放近端高压侧之前, 将墙壁压在一起的低压. 灌注立即进行移植, 并检查是否有可见的脉搏。轻轻地除去丝绸的残余。供体和受体主动脉的最佳重叠长度为 1-2 mm. 将腹内内容返回腹腔, 并用3-0 聚酸缝合闭合整个伤口. 在终止麻醉前给小鼠丁丙诺啡 (0.05 毫克/千克体重皮下 (SC)). 在完全清醒之前, 不要把动物留在无人看管的状态。管理疼痛治疗与 buprenophine 0.05 毫克/千克体重管理 SC 三次, 每天三天的行动后, 经机构监督机构批准. 用于组织捕捞, 麻醉上述的受体小鼠, 用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 冲洗血管, 然后用4% 甲醛/pbs (pH = 7.4) 通过心脏穿刺。轻轻取出移植物。经过隔夜固定4% 甲醛/PBS, 过程标本进一步和嵌入石蜡.

Representative Results

小鼠在15-30 分钟内从麻醉中恢复, 没有观察到身体损伤, 尽管血栓形成的风险很高。术后随访采用超声分析。在研究中使用的野生型小鼠, 其腔内的尺寸没有变化。因此, 没有观察到狭窄和动脉瘤形成。移植动物未能表现出血管壁的斑块发育 (图 2)。 常规染色方法如 immunohistology 可用于测定斑块、平滑肌细胞的形态和巨噬细胞的积累。在本研究中, 移植后6周进行组织学和免疫组化染色, 以检验移植物的完整性。组织学染色 (苏木精和曙红 (he) 和免疫组织化学染色 (平滑肌肌动蛋白 (SMA) 和巨噬细胞 (MAC2)) (图 3) 显示我们不变的平滑肌细胞分布模式, 完整的内皮细胞衬里, 没有细胞在内膜中的积累。这些结果表明, 移植血管中没有发现明显的病变或细胞活化 (图 3)。 图 1: 套筒技术.腹主动脉采用袖套法移植。在这个过程中, 捐献者的主动脉被放置在原位, 表面的叮咬存在于喂食容器中。请单击此处查看此图的较大版本. 图 2: 术中和超声图像.例术中 (尸检) 观察移植术后6周 (A), 其三维超声 (B) 和 B 模式视图 (C)。术后随访采用超声进行。图片显示了移植的通畅性, 在流明尺寸上没有变化。此外, 没有观察到狭窄或动脉瘤形成。请单击此处查看此图的较大版本. 图 3: 组织学和免疫组织化学图像.移植后6周移植动物的组织学和免疫组化代表图像。在移植脉中未观察到明显的病变 (苏木精和曙红, he, 100X 放大倍率, 刻度棒 = 50 µm), 免疫组织化学染色 (平滑肌肌动蛋白 SMA (红色), 或巨噬细胞 MAC2 (绿色), 200X 放大倍数, 刻度条 =25µm)。细胞核由 DAPI (蓝色) counter-stained。请单击此处查看此图的较大版本.

Discussion

在本研究之前, 对小鼠其他各种移植模型进行了全面分析^3,6,7,10,13,¹⁴。采用 Dambrin et al.修饰的袖状技术进行主动脉移植的模型选择, 因为它符合我们的标准, 并显示了与传统的端部缝合方法相比, 套管吻合的高可靠性^1,10。

这种技术在许多方面都是有利的, 阻断时间大大减少了手术期间对主动脉损伤的最小化。此外, 还观察到血栓形成率低的情况, 以避免捐赠者和受赠人之间的血管口径可能不匹配。上述观察使该技术非常适合于研究小鼠主动脉移植中的血管疾病。

在一项随访研究中, 超声在移植后8周内进行, 未发现明显的变化。这证实了在手术中对主动脉的任何损伤都是最小的¹。

本文提出的嫁接过程保证了移植物完整性和功能的不损害。因此, 这一实验性移植模型可以作为对基因工程小鼠退行性血管病的分子和药理学研究的重要工具。

我们认为, 视频指南可以作为教学材料, 说明使用这个简单的动动脉模型, 它将有助于进一步丰富的辩论中的许多重要问题的血管病理。这种快速吻合的方法可用于研究基因工程小鼠的血管疾病。它也可作为一种改良的动脉瘤模型结合移植。

在过程中有关键点。缝合线本身的放置是最关键的一步。外科医生必须小心, 以避免任何扭转的主动脉通过适当的协调捐助者和受体。在检查吻合口后, 要小心地取下夹具。远端钳位应始终首先释放导致低压保持墙壁在一起之前, 在近端高压侧释放。不正确地跟随释放序列的后果将是流血。

Materials

Halsey Needle Holder	Fine Science Tools	12001-13
Dumont #5-45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont #5 Forceps –	Fine Science Tools	11254-20
Lexer-Baby Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Castroviejo Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-01
Vannas Scissors	Aesculap, Germany	Typ OC498R
Castroviejo Suture Forceps	Geuder, Germany	19015
6-0 silk black (Silk)	Deknatel, Research Triangle Park NC, USA	18020-60- FST
11-0 monofilament (Ethilon)	Ethicon, Norderstedt, Germany	EH7438G
3-0 polyglycolic acid suture (Serafit)	Serag-Wiessner, Naila, Germany	60203214
Isofluorane	Any genericon
Heparin	Any genericon
0.9% saline	Any genericon
Buprenorphine	Any genericon
Bepanthene eye and nose cream	Bayer, Germany
Microscop	Zeiss	Opmi MDO/S5
Vaporiser	Eickemeyer	TEC3
Ultrasound	Vevo, Canada	770,2100