Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.
Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to “operational taxonomic units”; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage.
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.
Metagenomik är direkt analys av DNA renat från biologiska samhällen inom miljöprover 1 och användes ursprungligen för att upptäcka unculturable bakterier som finns i sedimenten 2. Metagenomik har använts i stor utsträckning för ett antal applikationer, såsom att identifiera den mänskliga microbiome 3, klassificera mikrobiella populationer i havet 4 och även för analys av bakterie samhällen som utvecklas på kaffemaskiner 5. Införandet av nästa generations sekvenseringsteknologier lett till större sekvense genomströmning och produktion. Följaktligen har DNA-sekvensering blir mer ekonomisk 6 och djupet av sekvensering som kan utföras har ökat kraftigt, vilket möjliggör metagenomik att bli ett kraftfullt, analytiskt verktyg.
"Front-end" förbättringar i den praktiska, molekylär aspekt av metagenomic sekvense har drivit tillväxten av isilico bioinformatiska verktyg tillgängliga för den taxonomiska klassificeringen 7-9, funktionell anteckning 10,11 och visuell representation 12,13 av DNA-sekvensdata. Det ökande antalet tillgängliga sekvens prokaryota och eukaryota 14 genomen tillåter ytterligare noggrannhet i klassificeringen av mikrobiella samhällen, som alltid utförs mot en "back-end" referensdatabas sekvensegenom 15. Två huvudmetoder kan antas för metagenomic analys.
Den mer konventionella metoden är analys av 16S rRNA-genen kodande regionen av bakteriella genomet. 16S rRNA är mycket konserverad mellan prokaryota arter men uppvisar nio hyper-variabla regioner (V1 – V9) som kan utnyttjas för identifiering 16 arter. Införandet av längre sekvensering (≤ 300 bp parade slut) tillåts för analys av DNA-sekvenser som spänner över två hyper-variabla regioner, i synnerhetV3 – V4-regionen 17. Framsteg i andra sekvenseringsteknologier, såsom Oxford nanopore 18 och PacBIO 19, tillåter hela 16S rRNA-genen som skall sekvenseras intill varandra.
Medan 16S rDNA baserade bibliotek ger en målinriktad strategi för artbestämning och möjliggöra detektering av lågt kopietal DNA som naturligt förekommer inom renade prover, hagelgevär sekvense bibliotek kan påvisas av arter som kan innehålla DNA-regioner som antingen inte amplifierbara av 16S rRNA markör primersekvenser används, eller på grund av skillnaderna mellan templatsekvensen och den förstärkande primersekvensen är alltför stora 20,21. Även om DNA-polymeraser har en high fidelity DNA-replikation, bas fel kan ändå förekomma under PCR-amplifiering och dessa inkorporerade fel kan leda till felaktiga klassificeringen av ursprungs arter 22. Bias i PCR-amplifieringen av templat sequences kan också förekomma; sekvenser av DNA med hög GC-halt kan vara underrepresenterade i den slutliga amplikonen poolen 23 och på liknande sätt onaturliga basmodifieringar, såsom tymin glykol, kan stoppa DNA-polymeraser som orsakar fel i amplifieringen av DNA-sekvenser 24. Däremot är ett hagelgevär-sekvensbestämning DNA-bibliotek ett DNA-bibliotek som har framställts genom att använda alla av den renade DNA som har extraherats från ett prov och därefter fragmenteras till kortare DNA-kedjelängder före beredning för sekvensering. Taxonomisk klassificering av DNA-sekvenser som genereras av shotgun-sekvensering är mer exakt jämfört med 16S rRNA amplikon sekvense 25, även om de finansiella kostnaderna som krävs för att nå en tillförlitlig sekvense djup är större än den för amplikon sekvense 26. Den största fördelen med hagelgevär sekvense metagenomik är att sekvense regioner i de olika genomen i provet är tillgängliga för gen prospektering när de har varithar taxonomiskt klassificerad 27.
Metagenomic sekvensdata analyseras av en ständigt ökande utbud av bioinformatiska verktyg. Dessa verktyg kan utföra en mängd olika tillämpningar, till exempel, kvalitetskontroll analys av råsekvensdata 28, överlappande av parade slut läser 29, de novo montering av sekvens läser till kontiger och ställningar 30,31, taxonomisk klassificering och visualisering sekvens läser och sammansatta sekvenser 7,12,32,33 och den funktionella anteckningen av sammansatta sekvenser 34,35.
Ensilage, som produceras av jordbrukare över hela världen från jästa spannmål såsom majs (Zea mays) är huvudsakligen används som kreatursfoder. Ensilage behandlas med bakterien Lactobacillus sp. för att underlätta fermenteringen 36 men hittills finns det begränsad kunskap om andra populationer av mikroorganismer som finns i ensilage. den fermentation process kan leda till oönskade och potentiellt skadliga mikroorganismer blir vanligare inom ensilaget 37. Förutom jäst och mögel, bakterier är särskilt anpassningsbara till den anaeroba miljön i fermen ensilage och är oftare associerade med sjukdomar hos boskap, snarare än nedbrytning av ensilaget 38. Smörsyrabakterier kan oavsiktligt tillsatta från jord kvar när fylla ensilagesilor och kan omvandla mjölksyra, en produkt av rötning, till smörsyra, vilket ökar pH i ensilaget 39. Denna ökning i pH kan leda till ett uppsving i nedbrytande bakterier som normalt inte skulle kunna upprätthålla tillväxten under optimala ensilagefermentationsbetingelser 38. Clostridium spp. , Listeria spp. och Bacillus spp. är av särskilt intresse, särskilt i ensilage för foder mjölkkor, som bakteriesporer som har överlevt gastrointestinal kanalen 40 kan komma in i livsmedelskedjan leda till mat förstörs och i sällsynta fall, till djur och mänskliga dödsfall 37,39,41-44. Dessutom medan det är svårt att uppskatta den exakta ekonomiska effekten av veterinärbehandling och boskap skada som orsakats av ensilage förruttnelse, är det sannolikt att vara till skada för en gård om ett utbrott skulle inträffa.
Det antas att vi med hjälp av en metagenomic tillvägagångssätt kan klassificera mikrobiella populationer som finns i ensilageprov och dessutom identifiera mikrobiella samhällen som är förknippade med ensilage nedbrytning som skulle i sin tur kunna ha en skadlig effekt på boskap, vilket möjliggör avhjälpande åtgärder för att vara tas före ensilaget skall användas som en näringskälla.
Medan en in silico analys kan ge en god inblick i de mikrobiella samhällen som finns i miljöprover, är det viktigt att de taxonomiska klassificering visade utföras i samarbete med relevanta kontroller och att en lämplig djup sekvensering har uppnåtts för att fånga hela population som finns 51.
Med någon beräknings analys, det finns många vägar för att uppnå ett liknande mål. De metoder som vi har använt i denna studie är exempel på lämpliga och enkla metoder, som har förts samman för att uppnå en rad analyser på ensilage microbiome. En mängd och ett ständigt ökande antal bioinformatiska verktyg och tekniker finns tillgängliga för att analysera metagenomic uppgifter, till exempel Phylosift 8 och MetaPhlAn2 52, och dessa bör utvärderas innan undersökningen för deras relevans till provet och analysen required 53. Metagenomic analysmetoder är begränsade av databaserna för tillgängliga för klassificering, sekvensedjup och kvaliteten på sekvensbestämning.
Den bioinformatik behandling visade här utfördes på en lokal, hög motordriven maskin; men molnbaserade system är också tillgängliga. Dessa molnbaserade tjänster gör det möjligt att hyra av den nödvändiga beräkningskraft utan att ha hög investeringskostnad av en lämplig stark lokal arbetsstation. En potentiell tillämpning av denna metod skulle vara att bedöma ensilage innan dess användning inom jordbruket för att säkerställa att inga potentiellt skadliga bakterier förekommer därför hindrar dem från att komma in i livsmedelskedjan.
The authors have nothing to disclose.
Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).
FastDNA SPIN Kit for Soil | MP Bio | 116560200 | DNA Extraction |
DNA FastPrep | MP Bio | 116004500 | DNA Extraction |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA Purification |
Elution Buffer | Qiagen | 19806 | DNA Purification |
Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | DNA Quantification |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | DNA Quantification |
Nextera XT DNA Library Prep Kit | Illumina | FC-131-1024 | Library Preparation |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Library Preparation |
TapeStation 2200 | Agilent | G2964AA | DNA Quantification |
HS D100 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA Quantification |
HS D100 ScreenTape Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA Quantification |
TapeStation Tips | Agilent | 5067-5153 | DNA Quantification |
TapeStation Tubes | Agilent | 401428 and 401425 | DNA Quantification |
HiSeq 2500 | Illumina | DNA Sequencing – provided by a sequencing service | |
High Power Analysis Workstation | Various | Local or cloud based, user preferred system |