هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية
Summary
يصف هذا التقرير طريقة الهندسة الحيوية لتصميم وبناء عوامل الربط الاصطناعي الجديدة (أسفس) التي تعدل على وجه التحديد الربط بين الجينات المستهدفة في خلايا الثدييات. ويمكن توسيع هذه الطريقة لمواصلة هندسة العوامل الاصطناعية المختلفة لمعالجة جوانب أخرى من عملية التمثيل الغذائي للحمض النووي الريبي.
Abstract
وتوسطت تجهيز معظم الرنا RNA حقيقية النواة من البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) مع تكوينات وحدات، بما في ذلك وحدة الاعتراف RNA، الذي يربط على وجه التحديد الهدف قبل مرنا ومجال المستجيب ملزم. سابقا، وقد استفدنا من الحمض النووي الريبي طريقة فريدة ملزم المجال PUF في Pumilio البشرية 1 لتوليد سقالة RNA ملزم للبرمجة، والتي كانت تستخدم لمهندس مختلف الممارسات التجارية التقييدية الاصطناعية للتلاعب استقلاب الحمض النووي الريبي. هنا، يوصف بروتوكول مفصلة لبناء عوامل الربط هندسة (كلية العلوم التربوية) التي تم تصميمها خصيصا لتعديل الربط البديلة من الجينات المستهدفة. ويتضمن البروتوكول كيفية تصميم وبناء سقالة PUF مخصصة لهدف معين RNA، وكيفية بناء تعبير البلازميد ESF عن طريق دمج مجال PUF مصمم ومجال المستجيب، وكيفية استخدام كلية العلوم التربوية لمعالجة الربط من الجينات المستهدفة. في نتائج تمثيلية لهذه الطريقة، التي وصفناها أيضا فحوصات مشتركةأنشطة كلية العلوم التربوية باستخدام صحفيين الربط، تطبيق ESF في الخلايا البشرية المستزرعة، وتأثير لاحق من التغييرات الربط. عن طريق اتباع بروتوكولات مفصلة في هذا التقرير، فمن الممكن لتصميم وتوليد كلية العلوم التربوية لتنظيم أنواع مختلفة من البديل الربط (AS)، وتوفير استراتيجية جديدة لدراسة تنظيم الربط وظيفة الإسوية الربط مختلفة. وعلاوة على ذلك، من خلال دمج مجالات وظيفية مختلفة مع مجال PUF تصميم، يمكن للباحثين مهندس العوامل المصطنعة التي تستهدف الرنا محددة لمعالجة مختلف مراحل معالجة RNA.
Introduction
معظم الجينات البشرية تخضع البديلة الربط (أس) لإنتاج الأشكال الإسوية متعددة مع أنشطة متميزة، مما زاد كثيرا من تعقيد الترميز من الجينوم 1 ، 2 . أس يوفر آلية رئيسية لتنظيم وظيفة الجينات، وينظم بإحكام من خلال مسارات متنوعة في مختلف مراحل الخلوية والتنموية 3 ، 4 . لأن الربط سوء التنظيم هو سبب شائع للمرض البشري 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، استهداف تنظيم الربط أصبح طريقا علاجيا جذابا.
وفقا لنموذج مبسط لتنظيم الربط، يتم التحكم أس أساسا عن طريق الربط التنظيمية سيس -Elements (سريس) في مرحلة ما قبل الرنا المرسال التي تعمل كما تعزيز الربط أو كاتمات الصوت من إكسونس البديلة. ثإيس سريس على وجه التحديد تجنيد مختلف العوامل عبر البروتين المتفاعلة ( أي عوامل الربط) التي تعزز أو قمع رد فعل الربط 3 ، 9 . معظم معاملات الربط عبر ترانزلاتينغ لها نطاقات تسلسل رنا منفصلة تسلسل محددة للاعتراف أهدافها ومجالات المستجيب للسيطرة على الربط. الأمثلة الأكثر شهرة هي أعضاء عائلة البروتين سيرين / أرجينين الغنية (سر) التي تحتوي على N- محطة رنا التعرف على الزخارف (رمز)، التي تربط تعزيز الربط إكسونيك، والمجالات C- محطة رس، التي تعزز إدراج اكسون 10 . على العكس من ذلك، يرتبط هنرنب A1 كواتم الصوت الربط إكسونيك من خلال مجالات رم ويمنع إدراج اكسون من خلال C- محطة غلايسين الغنية المجال 11 . باستخدام هذه التكوينات وحدات، يجب أن يكون الباحثون قادرين على هندسة عوامل الربط الاصطناعي من خلال الجمع بين مجال محدد رنا ملزمة (ربد) مع مختلف إفيكتور المجالات التي تنشط أو تثبط الربط.
مفتاح مثل هذا التصميم هو لاستخدام RBD التي تعترف نظرا أهداف مع خصوصية ملزمة RNA للبرمجة، والتي هي مماثلة لوضع الحمض النووي ملزم المجال حكاية. ومع ذلك، فإن معظم عوامل الربط الأم تحتوي على RRM أو K التماثل (KH) المجالات، والتي تعترف عناصر RNA قصيرة مع ضعف تقارب وبالتالي تفتقر إلى التنبؤي RNA البروتين الاعتراف "كود" (12). وRBD من البروتينات تكرار PUF (أي المجال PUF) لديه واسطة الاعتراف RNA فريدة من نوعها، والسماح لإعادة تصميم المجالات PUF الاعتراف تحديدا RNA مختلفة تستهدف 13 و 14. يحتوي المجال PUF الكنسي ثمانية تكرارات لثلاث α-اللوالب، كل الاعتراف قاعدة واحدة في RNA الهدف 8 الإقليم الشمالي. سلاسل الجانب من الأحماض الأمينية في مواقع معينة من ثاني شكل α حلزون روابط هيدروجينية معينة مع حافة واطسون كريك-رقال النووي الريبي قاعدة، والذي يحدد خصوصية ملزم RNA من كل تكرار (الشكل 1A). رمز للاعتراف قاعدة RNA من تكرار PUF بسيط من المستغرب (الشكل 1A)، والسماح لتوليد المجالات PUF التي تعترف أي مزيج 8-قاعدة ممكن (التي استعرضتها وي وانغ 15).
هذا المبدأ تصميم وحدات يسمح للجيل من المهندسة الربط عامل (ESF) التي تتكون من مجال PUF مرغوب و مجال الربط تعديل (أي مجال SR أو مجال الغليسين الغنية). ويمكن لهذه كلية العلوم التربوية تعمل إما تفعيل الربط أو مثبطات للسيطرة على أنواع مختلفة من الأحداث الربط، وأنها أثبتت مفيدة كأدوات لمعالجة الربط الجينات الذاتية المتعلقة الأمراض التي تصيب البشر 16 و 17. وكمثال على ذلك، ونحن قد شيدت PUF-الغليسين من نوع كلية العلوم التربوية لتغيير وجه التحديد الربط للبي سي إل س الجين، وتحويل إسوفورم طويلة موت الخلايا المبرمج (بكل-زل) إلى إسوفورم قصيرة الموالية المبرمج (بكل-شس). كان تحويل نسبة إيسوفورم بكل-x كافية لتوعية العديد من الخلايا السرطانية للعديد من الأدوية المضادة للسرطان العلاج الكيميائي 16 ، مما يشير إلى أن هذه العوامل الاصطناعية قد تكون مفيدة ككواشف العلاجية المحتملة.
بالإضافة إلى التحكم في الربط مع النطاقات المعروفة المستجيب الربط (على سبيل المثال، رس أو المجال غلي الغنية)، ويمكن أيضا أن تستخدم عوامل بوف المهندسة لفحص أنشطة عوامل الربط الجديدة. على سبيل المثال، باستخدام هذا النهج، أثبتنا أن المجال C- محطة من عدة بروتينات سر يمكن تفعيل أو تمنع الربط عند ربط لمختلف مناطق ما قبل مرنا 18 ، أن عزر ألانين من RBM4 يمكن أن تمنع الربط 19 ، وأن يمكن لعزر البرولين الغنية DAZAP1 تعزيز الربط 20 ، 21 </ سوب>. هذه المجالات وظيفية جديدة يمكن استخدامها لبناء أنواع إضافية من عوامل مصطنعة إلى الربط صقل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم هذا التقرير وصفا تفصيليا لتصميم وبناء عوامل الربط المصطنعة التي يمكن التلاعب على وجه التحديد الربط البديلة من الجينات المستهدفة. يأخذ هذا الأسلوب الاستفادة من RNA طريقة فريدة ملزم من PUF يكرر لإنتاج سقالة ملزم RNA مع خصوصية مخصصة. ويمكن استخدامه إما تنشيط أو قمع الر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R01-CA158283 وNSFC منح 31400726 لZWYW يموله برنامج المواهب الشابة ألف ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (منح 31471235 و81422038). ويتم تمويل XY من قبل مؤسسة العلوم ما بعد الدكتوراه من الصين (2015M571612).
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
- Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
- Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
- Wang, G. -. S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
- Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
- Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
- Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -. C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
- Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
- Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
- Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
- Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
- Wang, Y., Cheong, C. -. G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
- Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
- Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
- McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
- Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
- Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
- Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
- Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
- Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
- Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
- He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732 (2009).
- Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
- Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).
- David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
- Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
- Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
- Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).
