परिवेश पार्टिकुलेट मैटर प्रेरित गुणसूत्र aberrations के विश्लेषण से एक का उपयोग<em> इन विट्रो</em> सिस्टम
Summary
इस प्रोटोकॉल परिवेशी वायु बात कण के साथ उपचार के बाद मात्रा का ठहराव और RAW264.7 माउस मैक्रोफेज में इन विट्रो में गुणसूत्र aberrations के लक्षण वर्णन के लिए तकनीक का वर्णन है।
Abstract
बात कण (प्रधानमंत्री) के संपर्क में एक प्रमुख विश्व स्वास्थ्य चिंता का विषय है, जो परमाणु आनुवंशिक सामग्री सहित विभिन्न सेलुलर घटकों, नुकसान हो सकता है। परमाणु आनुवंशिक अखंडता पर प्रधानमंत्री के प्रभाव का आकलन करने के लिए, संरचनात्मक गुणसूत्र aberrations माउस RAW264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं की metaphase फैलता में रन बनाए हैं। प्रधानमंत्री एक उच्च मात्रा की कुल निलंबित कणों पारखी के साथ परिवेशी वायु से एकत्र किया जाता है। एकत्र सामग्री solubilized और पानी में घुलनशील है, ठीक भाग बनाए रखने के लिए फ़िल्टर किया जाता है। कणों परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा रासायनिक संरचना के लिए विशेषता है। कण निलंबन के विभिन्न सांद्रता 72 घंटा की कुल जोखिम समय के लिए RAW264.7 माउस मैक्रोफेज की इन विट्रो संस्कृति पर जोड़ा जाता है, अनुपचारित नियंत्रण कक्षों के साथ। जोखिम के अंत में, संस्कृति metaphase में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने colcemid के साथ व्यवहार किया जाता है। कोशिकाओं तो काटा, hypotonic समाधान, acetomethanol में तय हो, डी के साथ व्यवहार कर रहे हैंगिलास स्लाइड पर ropped और अंत में Giemsa समाधान के साथ दाग। स्लाइड में संरचनात्मक गुणसूत्र aberrations (सीए) metaphase फैलता 1,000X बढ़ाई पर एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग आकलन करने के लिए जांच कर रहे हैं। 50 से 100 metaphase प्रसार प्रत्येक उपचार के समूह के लिए रन बनाए हैं। इस तकनीक को इस तरह के chromatid प्रकार टूटता है, chromatid प्रकार के आदान-प्रदान, acentric टुकड़े, dicentric और अंगूठी गुणसूत्रों, डबल मिनट, endoreduplication, और प्रधानमंत्री से संपर्क के बाद इन विट्रो में Robertsonian ट्रांसलोकेशन के रूप में संरचनात्मक गुणसूत्र aberrations (कैस), का पता लगाने के लिए अनुकूलित है। यह epigenetic परिवर्तन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित cytogenetic समापन बिंदु संबद्ध करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है।
Introduction
यह अनुमान लगाया गया है कि बात कण (प्रधानमंत्री) के लिए जोखिम 3 लाख से अधिक लोगों की मृत्यु सालाना अतिरिक्त, मुख्य रूप से हृदय रोग और फेफड़ों के कैंसर का कारण बनता है 1 से किया गया है। दरअसल, प्रधानमंत्री, अनुसंधान कर्क राशि के लिए अंतरराष्ट्रीय एजेंसी (समूह 1) द्वारा मनुष्य के लिए कैंसर के रूप में मान्यता दी गई थी के रूप में प्रधानमंत्री के लिए जोखिम के स्तर को बढ़ाने के साथ फेफड़ों के कैंसर का खतरा बढ़ 2 दिखाया गया है। दिलचस्प है, लगभग सभी कैंसर की कोशिकाओं संख्यात्मक और / या संरचनात्मक गुणसूत्र असामान्यताओं बंदरगाह। पार्टिकुलेट कार्बनिक कार्बन एक संस्करण है, जटिल है, और विषम मिश्रण, जिसकी संरचना और आकार के वितरण के उत्सर्जन के साथ ही भौतिक और रासायनिक परिवर्तनों पर निर्भर करता है। यह शहरी PM 2.5 द्रव्यमान का 35-55% (प्रधानमंत्री 2.5 माइक्रोन आकार में और छोटे) और ग्रामीण पृष्ठभूमि और महाद्वीपीय PM 2.5 बड़े पैमाने पर 3, 4 के 60% से अधिक से खातों। पानी में घुलनशील अंश कार्बनिक एयरोसोल का 30-90% के लिए खातों। कार्बनिक यौगिकों की एक बड़ी संख्यापहचान की गई है स्निग्ध हाइड्रोकार्बन, पॉलीसाइक्लिक सुरभित हाइड्रोकार्बन, और उनके ऑक्सीजन और nitrated डेरिवेटिव, स्निग्ध एल्डीहाइड और एल्कोहल, मुक्त फैटी एसिड और उनके लवण, डि-कार्बोक्जिलिक एसिड, multifunctional यौगिकों, प्रोटीन, और humic-जैसे बड़े अणुओं (HULIS) का उपयोग भी शामिल chromatographic तरीकों बड़े पैमाने पर spectrometric तकनीक 5-8 के साथ मिलकर। इन यौगिकों, कण जैविक कार्बन का कम से कम 10-20% का प्रतिनिधित्व करते हैं, इस प्रकार जैविक कार्बन के सबसे अज्ञात 9 है।
प्रायोगिक सबूत बताते हैं कि cytotoxicity, oxidative तनाव, सूजन और प्रधानमंत्री से जुड़े रोग राज्यों के विकास में शामिल रहे हैं। यह हाल ही में दिखाया गया है, हालांकि, प्रधानमंत्री के लिए है कि जोखिम भी दोहराए तत्वों के डीएनए मेथिलिकरण में परिवर्तन सहित epigenetic परिवर्तन की एक संख्या में, इन विट्रो प्रणालियों में और मानव विषयों 10-12 में यह परिणाम दोनों प्रयोगात्मक में। खास रुचि के प्रभाव हैंबड़े और छोटे उपग्रहों – – गुणसूत्रों के गुणसूत्रबिंदु आसपास heterochromatic क्षेत्र में पाए जाते हैं जो उपग्रह डीएनए पर PM। यह दिखाया गया था इन प्रभावों, स्वभाव से लगातार हो सकता है कि के रूप में वे जोखिम 12 के बाद कम से कम 72 घंटे के लिए पता लगाया जा सकता है। डीएनए मेथिलिकरण में बदलाव, विशेष रूप से centromeres के आसपास, कोशिका विभाजन के दौरान उपग्रह डीएनए mRNA टेप, समझौता गुणसूत्र अखंडता के संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और बाद में, रोग राज्यों 13 की एक किस्म के विकास में परिणाम।
पीएम की वजह से epigenetic परिवर्तन की एक अंत बिंदु के रूप में सीए के विश्लेषण के लिए cytogenetic दृष्टिकोण के अनुकूलन, इस प्रकार, उच्च महत्व का है। यहाँ, हम परिवेश PM संग्रह और तैयारी के लिए दृष्टिकोण, इन विट्रो जोखिम और कैस के विश्लेषण में murine बृहतभक्षककोशिका RAW264.7 मॉडल प्रणाली का उपयोग करते हुए रिपोर्ट। मैक्रोफेज साँस विदेशी वस्तुओं के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति में शामिल है और, इसलिए, टीउसके सेल लाइन की स्थापना की एक और कण विष विज्ञान 11, 12, 14, 15 में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया मॉडल के रूप में कार्य करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytogenetic अध्ययन या नंबर या गुणसूत्रों, मुख्य रूप से metaphase फैलता में की संरचनाओं का सूक्ष्म विश्लेषण, सूचना रोग का निदान, जोखिम मूल्यांकन, और विभिन्न रोगों के लिए इलाज के लिए महत्वपूर्ण है। अब यह अच्छी तरह से स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम समर्थित किया गया था, जैविक अनुसंधान उत्कृष्टता [अनुदान संख्या 1P20GM109005], नेशनल एयरोनॉटिक्स एंड स्पेस एडमिनिस्ट्रेशन [अनुदान संख्या NNX15AK32A] के माध्यम से अरकंसास अंतरिक्ष अनुदान कंसोर्टियम के स्वास्थ्य केंद्र के राष्ट्रीय संस्थान और व्यावसायिक सुरक्षा के लिए राष्ट्रीय संस्थान और से स्वास्थ्य (NIOSH) [अनुदान संख्या 2T420H008436]। लेखकों proofreading और इस पांडुलिपि संपादन के लिए क्रिस्टोफर Fettes को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- . . IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
