Analyse van de Ambient Particulate Matter-geïnduceerde chromosomale afwijkingen met behulp van een<em> In Vitro</em> Systeem
Summary
Dit protocol beschrijft technieken voor de kwantificatie en karakterisatie van chromosomale afwijkingen in vitro in RAW264.7 muis macrofagen na behandeling met de lucht zwevende deeltjes.
Abstract
Blootstelling aan fijn stof (PM) is een grote wereld gezondheids-zorg, waarin verschillende cellulaire componenten, met inbegrip van de nucleaire genetisch materiaal kunnen beschadigen. Om de impact van PM op de nucleaire genetische integriteit te beoordelen, zijn structurele chromosoomafwijkingen scoorde in de metafase spreads van de muis RAW264.7 macrofaag-cellen. PM wordt verzameld uit de lucht met een hoog volume totaal zwevende deeltjes sampler. Het verzamelde materiaal wordt opgelost en gefiltreerd om het in water oplosbare, fijn gedeelte behouden. De deeltjes worden gekenmerkt chemische samenstelling door middel van kernspinresonantie (NMR) spectroscopie. Verschillende concentraties deeltjessuspensie wordt toegevoegd aan een in vitro kweek van RAW264.7 muizenmacrofagen een totale blootstellingsduur van 72 uur, samen met onbehandelde controlecellen. Aan het einde van de blootstelling, is de cultuur behandeld met colcemide om cellen te arresteren in metafase. De cellen worden daarna geoogst, behandeld met een hypotone oplossing, in acetomethanol vaste, dropped op glasplaatjes en tenslotte gekleurd met Giemsa oplossing. Dia's worden onderzocht om de structurele chromosoomafwijkingen (CA's) in metafase spreads op 1000x met behulp van een bright-field microscoop te beoordelen. 50-100 metafase spread worden gescoord voor elke behandeling groep. Deze techniek is aangepast voor het vaststellen van structurele chromosoomafwijkingen (CA), zoals chromatidetype breaks, chromatidetype uitwisseling, acentrische fragmenten dicentrische en ring chromosomen, dubbele minuten endoreduplicatie en Robertsonian translocaties in vitro na blootstelling aan PM. Het is een krachtige methode om een gevestigde cytogenetische eindpunt epigenetische veranderingen associëren.
Introduction
Er wordt geschat dat blootstelling aan fijn stof (PM) zorgt ervoor dat meer dan 3 miljoen extra doden per jaar, vooral uit hart- en vaatziekten en longkanker 1. Inderdaad, PM werd erkend als kankerverwekkend voor de mens door het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek (groep 1), zoals een verhoogd risico op longkanker met toenemende niveaus van blootstelling aan PM is aangetoond 2. Interessant bijna alle kankercellen haven numerieke en / of structurele chromosomale abnormaliteiten. Particulate organische koolstof is een variant, complex en heterogeen mengsel, waarvan de samenstelling en de grootte verdeling is afhankelijk van de emissie evenals fysieke en chemische transformaties. Zij vertegenwoordigt 35-55% van de stedelijke PM 2,5 massa (PM 2,5 micrometer in grootte en kleiner) en meer dan 60% van de landelijke en continentale achtergrond PM 2,5 massa 3, 4. Het water oplosbare fractie is goed voor 30-90% van de organische aerosol. Een groot aantal organische verbindingenzijn geïdentificeerd, waaronder alifatische koolwaterstoffen, polycyclische aromatische koolwaterstoffen en de geoxygeneerde en genitreerde derivaten, alifatische aldehyden en alcoholen, vrije vetzuren en zouten daarvan, di-carbonzuren, multifunctionele verbindingen, eiwitten en humus-achtige macromoleculen (HULIS) middels chromatografische methoden gekoppeld aan massaspectrometrische technieken 5-8. Deze verbindingen vertegenwoordigen minder dan 10-20% van de deeltjes organische koolstof, waardoor het grootste deel van organische koolstof is niet bekend 9.
Experimenteel bewijs suggereert dat cytotoxiciteit, oxidatieve stress en ontstekingen zijn betrokken bij de ontwikkeling van PM-geassocieerde pathologische toestanden. Onlangs is echter aangetoond dat blootstelling aan PM resulteert ook in een aantal epigenetische veranderingen, zoals veranderingen in DNA methylering van repetitieve elementen, in zowel experimentele in vitro systemen en bij de mens 10-12. Van bijzonder belang zijn de effecten vanPM op satelliet DNA – grote en kleine satellieten – die worden aangetroffen in de heterochromatische regio rond het centromeer van chromosomen. Er werd aangetoond dat deze effecten persistent van aard kunnen zijn, als ze kunnen worden gedetecteerd gedurende ten minste 72 uur na blootstelling 12. Veranderingen in DNA-methylering, met name rond centromeren, kan leiden tot ophoping van satelliet DNA mRNA transcripten, chromosomale integriteit compromis tijdens de celdeling en vervolgens leiden tot de ontwikkeling van een verscheidenheid aan pathologische toestanden 13.
Aanpassing van cytogenetische benadering voor de analyse van CA als eindpunt van epigenetische veranderingen veroorzaakt door PM dus van groot belang. Hier melden wij de aanpak voor de ambient PM collectie en de voorbereiding, in vitro blootstelling en analyse van CA's met behulp van de muizen macrofaag RAW264.7 modelsysteem. Macrofagen bestaat uit de eerste lijn van verdediging tegen de ingeademde vreemde voorwerpen en dus tZijn cellijn dient als een gevestigde en de meest gebruikte model in deeltje toxicologie 11, 12, 14, 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytogenetische studie of microscopische analyse van de nummers of structuren van chromosomen, vooral in metafase spreads, geeft informatie van cruciaal belang voor de prognose, risicobeoordeling, en de behandeling van diverse ziekten. Het is nu goed vastgesteld dat cytogenetische afwijkingen verbonden met de voortgang en ontwikkeling van verschillende ziekten, waaronder kanker. Tot op heden zijn CA gevonden in alle belangrijke tumortypen. Een van de belangrijkste externe risicofactoren die verschillende soorten cytogene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund, gedeeltelijk, door de National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [subsidie nummer 1P20GM109005], de Arkansas Space Grant Consortium door de National Aeronautics and Space Administration [subsidie nummer NNX15AK32A], en het Nationaal Instituut voor Veiligheid en Health (NIOSH) [subsidie nummer 2T420H008436]. De auteurs willen graag Christopher Fettes bedanken voor het corrigeren en redigeren dit manuscript.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- . . IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
