Analyse av Ambient Svevestøv-indusert kromosomavvik ved hjelp av en<em> In Vitro</em> System

Summary

Denne protokollen beskriver teknikker for kvantifisering og karakterisering av kromosomale avvik in vitro i RAW264.7 musemakrofager etter behandling med omgivende luft partikler.

Abstract

Eksponering for svevestøv (PM) er en stor verden helse bekymring, noe som kan skade ulike cellulære komponenter, inkludert kjernefysisk genetisk materiale. For å vurdere effekten av PM på kjernefysisk genetisk integritet, er strukturelle kromosomavvik scoret i de metafase sprer av mus RAW264.7 makroceller. PM er hentet fra luften med et høyt volum total suspenderte partikler sampler. Det oppsamlede materiale er oppløst, og filtrert for å holde den vannoppløselige, fine parti. Partiklene er kjennetegnet for den kjemiske sammensetning av kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Forskjellige konsentrasjoner av partikkelsuspensjonen blir tilsatt til en in vitro-kultur av RAW264.7 musemakrofager for en total eksponeringstid på 72 timer, sammen med ubehandlede kontrollceller. På slutten av eksponeringen, blir kulturen behandlet med colcemid å stanse celler i metafase. Cellene blir så høstet, behandlet med hypoton oppløsning, fiksert i acetomethanol, dropped på glassplater og til slutt farget med Giemsa løsning. Lysbilder blir undersøkt for å vurdere strukturelle kromosomavvik (CAS) i metafase sprer på 1,000X forstørrelse ved hjelp av en lys-feltet mikroskop. 50-100 metafase spredning er scoret for hver behandlingsgruppe. Denne teknikken er tilpasset for påvisning av strukturelle kromosomavvik (CAS), som kromatid-type pauser, kromatid-type utveksling, asentrisk fragmenter, disentrisk og ring kromosomer, dobbel minutter, endoreduplication og Robertsonske trans in vitro etter eksponering for PM. Det er en kraftig metode for å knytte et veletablert cytogenetisk endepunkt til epigenetiske forandringer.

Introduction

Det har blitt anslått at eksponering for svevestøv (PM) forårsaker over 3 millioner overflødig dødsfall årlig, hovedsakelig fra hjerte- og karsykdommer og lungekreft ^en. Faktisk PM ble anerkjent som kreftfremkallende for mennesker ved International Agency for Research on Cancer (gruppe 1), som økt risiko for lungekreft med økende nivåer av eksponering for PM har blitt vist ^to. Interessant, nesten alle kreftceller havn numeriske og / eller strukturelle kromosomavvik. Partikkelformet organisk karbon er en variant, kompleks, og heterogen blanding, hvis sammensetning og størrelsesfordeling avhenger av utslipp, så vel som fysiske og kjemiske omdannelser. Det står 35-55% av urban PM _2,5 masse (PM 2,5 mikrometer i størrelse og mindre) og mer enn 60% av landlige og kontinentale bakgrunn PM _2,5 masse ^{tre, fire.} Den vannløselig fraksjon står for 30-90% av organisk aerosol. Et stort antall organiske forbindelserer blitt identifisert, inkludert alifatiske hydrokarboner, polysykliske aromatiske hydrokarboner og deres oksygenerte og nitrerte derivater, alifatiske aldehyder og alkoholer, frie fettsyrer og deres salter, dikarboksylsyrer, multifunksjonelle forbindelser, proteiner og humuslignende makromolekyler (HULIS) ved hjelp kromatografiske metoder kombinert med massespektrometri teknikker ^5-8. Disse forbindelser utgjør mindre enn 10-20% av partikkelformet organisk karbon, og således de fleste av organisk karbon er ukjent ^9.

Eksperimentelle bevis tyder på at cytotoksisitet, oksidativt stress og betennelse er involvert i utviklingen av PM-assosierte patologiske tilstander. Det har nylig blitt vist, men at utsettelse for PM resulterer også i en rekke epigenetiske endringer, inkludert forandringer i DNA-metylering av repetitive elementer, i både eksperimentelle in vitro-systemer, og i mennesker ^10-12. Av spesiell interesse er virkningen avPM på satellitt DNA – store og små satellitter – som er funnet i heterochromatic regionen rundt cent av kromosomer. Det ble vist at disse effekter kan vedvare av natur, som de kan påvises i minst 72 timer etter eksponering ^12. Endringer i DNA-metylering, spesielt rundt sentromerer, kan føre til akkumulering av satellitt-DNA-mRNA-transkripter, kompromiss kromosomalt integritet under celledeling og, senere, resulterer i utvikling av en rekke patologiske tilstander ^13.

Tilpasning av cytogenetisk tilnærming for analyse av instanser som et sluttpunkt av epigenetiske endringer forårsaket av PM, derfor er av stor betydning. Her rapporterer vi tilnærming for omgivelses PM innsamling og forberedelse, in vitro eksponering og analyse av instanser bruker murine makrofag RAW264.7 modellsystem. Makrofager utgjør den første forsvarslinje mot inhalerte fremmedlegemer og derfor tsin cellelinje tjener som en etablert og den mest brukte modellen i partikkel toksikologi ^{11, 12, 14, 15.}

Protocol

1. Partikkel Collection og klargjøring Kalibrering av høyt volum total suspenderte partikler sampler Frakoble sampler motoren fra massestrømningsregulatoren og kobler motoren til en stabil strømkilden (figur 1). MERK: Et filter brukes ikke under denne prosedyren. Monter kalibratoren åpning og topplading av adapterplaten til sampler. Stram de beste lasting adapter hold-down nøtter sikkert for å sikre at ingen luftlekkasjer er til stede. Tillat …

Representative Results

Stor forsiktighet bør utvises i å velge plasseringen av TSP sampler, samt den tiden av året når samlingen er utført. Den kjemiske sammensetningen, så vel som størrelsen på partiklene kan i vesentlig grad påvirke resultatene. Det innsamlede materialet skal være synlig mot den hvite filteret. En vanlig mus metafase spredning vil ha 40 asentrisk kromosomer. Målet med teknikken er å påvise en endring (eller mangel på sådan) i andelen av unormale kromosomer i behandlede celler …

Discussion

Cytogenetisk undersøkelse eller mikroskopisk analyse av tallene eller strukturer av kromosomer, først og fremst i metafase sprer seg, gir informasjon avgjørende for prognose, risikovurdering, og behandling for ulike sykdommer. Det er nå godt etablert som cytogenetiske abnormiteter er forbundet med progresjon og utvikling av en rekke sykdommer, inkludert kreft. Hittil har instanser blitt funnet i alle de store krefttyper. CAer kan oppstå spontant eller av enten eksterne eller interne stimuli, slik som ioniserende st…

Materials

Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37°C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37°C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37°C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37°C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37°C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA