Analys av omgivnings Partiklar-inducerad kromosomavvikelser Använda en<em> In Vitro</em> System

Summary

Detta protokoll beskriver tekniker för kvantifiering och karakterisering av kromosomavvikelser in vitro i RAW264.7 mus makrofager efter behandling med omgivande luft partiklar.

Abstract

Exponering för partiklar (PM) är en av världens viktigaste hälsoproblem, som kan skada olika cellkomponenter, inklusive kärn genetiska materialet. För att bedöma effekterna av PM på kärn genetisk integritet, är strukturella kromosomavvikelser görs i metafas spreadarna mus RAW264.7 makrofagceller. PM samlas in från luften med hög volym totalt suspenderade partiklar sampler. Det insamlade materialet solubiliseras och filtreras för att kvarhålla den vattenlösliga, fina delen. Partiklarna kännetecknas för kemisk sammansättning med kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Olika koncentrationer av partikelsuspension tillsätts på en in vitro-kultur av RAW264.7 musmakrofager för en total exponeringstid av 72 h, tillsammans med obehandlade kontrollceller. I slutet av exponeringen är kulturen behandlas med kolcemid att stoppa celler i metafas. Cellerna skördas sedan, behandlades med hypoton lösning, fixerades i acetomethanol, dropped på objektglas och slutligen färgades med Giemsa-lösning. Diabilder undersöks för att bedöma de strukturella kromosomavvikelser (CAS) i metafas sprider på 1,000X förstoring med hjälp av en ljus-fält mikroskop. 50 till 100 metafas spridning poängsätts för varje behandlingsgrupp. Denna teknik är anpassad för att detektera strukturella kromosomavvikelser (CA), såsom kromatid-typ raster, kromatid-typ utbyten, acentrisk fragment, dicentric och ring kromosomer, dubbla minuter, endoreduplikation och Robertsonian translokationer in vitro efter exponering för PM. Det är en kraftfull metod för att associera en väletablerad cytogenetisk slutpunkt för epigenetiska förändringar.

Introduction

Det har uppskattats att exponering för partiklar (PM) orsakar över 3 miljoner överskott dödsfall årligen, främst från hjärt-kärlsjukdomar och lungcancer ^1. I själva verket var PM erkänd som cancerframkallande för människor från International Agency for Research on Cancer (grupp 1), som en ökad risk för lungcancer med ökande nivåer av exponering för PM har visats ^två. Intressant, nästan alla cancerceller hamnen numeriska och / eller strukturella kromosomavvikelser. Partikulärt organiskt kol är en variant, komplex och heterogen blandning, vars sammansättning och storleksfördelning beror på utsläppen samt fysiska och kemiska omvandlingar. Det står 35-55% av stads PM _2,5 massa (PM 2,5 mikrometer i storlek och mindre) och mer än 60% av landsbygden och kontinental bakgrund PM _2,5 massa ^{3, 4.} Den vattenlösliga fraktionen står för 30-90% av organisk aerosol. Ett stort antal organiska föreningarhar identifierats, inklusive alifatiska kolväten, polycykliska aromatiska kolväten och deras oxygene och nitroderivat, alifatiska aldehyder och alkoholer, fria fettsyror och deras salter, dikarboxylsyror, multifunktionella föreningar, proteiner och humusliknande makromolekyler (HULIS) med hjälp av kromatografiska metoder i kombination med masspektrometriska tekniker ^5-8. Dessa föreningar utgör mindre än 10-20% av partikulärt organiskt kol, vilket de flesta av organiskt kol är okänt ^9.

Experimentellt bevis antyder att cytotoxicitet, oxidativ stress, och inflammation är involverade i utvecklingen av PM-associerade patologiska tillstånd. Det har nyligen visats, dock att exponering för PM resulterar också i ett antal epigenetiska förändringar, bland annat förändringar i DNA-metylering av repetitiva element, både experimentella in vitro-system och hos människa ^10-12. Av särskilt intresse är effekterna avPM på satellit DNA – stora och små satelliter – som finns i heterochromatic regionen runt centromeren av kromosomer. Det visade sig att dessa effekter kan vara långlivade av naturen, eftersom de kan detekteras under minst 72 timmar efter exponering ^12. Förändringar i DNA-metylering, särskilt runt centromerer, kan leda till ansamling av satellit DNA mRNA-transkript, kompromiss kromosom integritet under celldelning och därefter leda till utvecklingen av en mängd olika patologiska tillstånd ^13.

Anpassning av cytogenetisk tillvägagångssätt för analys av CA som en slutpunkt av epigenetiska förändringar orsakade av PM, vilket är av stor betydelse. Här rapporterar vi tillvägagångssättet för den omgivande PM insamling och förberedelse in vitro exponering och analys av CA med hjälp av mus makrofag RAW264.7 modellsystem. Makrofager omfattar första försvarslinjen mot de inhalerade främmande föremål och därmed thans cellinje fungerar som en etablerad och mest använda modellen i partikel toxikologi ^{11, 12, 14, 15.}

Protocol

1. Partikel Insamling och förberedelse Kalibrering av hög volym totalt suspenderade partiklar sampler Koppla provtagaren motorn från massflödesstyrenheten och ansluta motorn till en stabil växelströmskälla (Figur 1). OBS: Ett filter används inte under denna procedur. Montera kalibrator öppningen och toppmatad adapterplatta till provtagaren. Dra åt toppmatade adapter nedhållande muttrar säkert att säkerställa att inga luftläckage är n?…

Representative Results

Stor försiktighet bör iakttas vid valet av placeringen av TSP provtagaren, såväl som den tid på året då insamlingen utförs. Den kemiska sammansättningen såväl som storleken på partiklarna kan väsentligen påverka resultaten. Det insamlade materialet ska vara synlig mot den vita filter. En vanlig mus metafas spridning kommer att ha 40 acentrisk kromosomer. Målet med tekniken är att visa en förändring (eller frånvaro därav) av andelen onormala kromosomer i behandlade cel…

Discussion

Cytogenetisk studie eller mikroskopisk analys av siffrorna eller strukturer av kromosomer, främst i metafas sprider sig, innehåller information av avgörande betydelse för prognos, riskbedömning och behandling av olika sjukdomar. Det är nu väl etablerat att cytogenetiska abnormiteter är kopplade till utvecklingen och utvecklingen av flera sjukdomar, bland annat cancer. Hittills har CAs hittats i alla större tumörtyper. CA kan uppstå spontant eller av antingen externa eller interna stimuli, såsom joniserande s…

Materials

Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37°C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37°C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37°C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37°C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37°C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA