पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em> इन विट्रो</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
इन विट्रो में अभिन्न झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन अक्सर एक हाइड्रोफोबिक transmembrane डोमेन की मौजूदगी से जटिल कर रहे हैं। इसके अलावा इन अध्ययनों उलझी, liposomes में डिटर्जेंट solubilized झिल्ली प्रोटीन की reincorporation एक स्टोकेस्टिक प्रक्रिया जहां प्रोटीन टोपोलॉजी लागू करने के लिए असंभव है। इस पत्र इन चुनौतीपूर्ण तकनीक है कि एक liposome आधारित पाड़ का इस्तेमाल करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है। प्रोटीन घुलनशीलता transmembrane डोमेन का विलोपन द्वारा बढ़ाया है, और इन अमीनो एसिड जैसे एक उनकी टैग के रूप में, एक tethering आधा भाग के साथ बदल रहे हैं। यह तार एक प्रस्तोता समूह (नी 2 + nitrilotriacetic एसिड (NTA (नी 2 +)) उनकी टैग प्रोटीन के लिए समन्वित द्वारा) है, जो liposome की सतह पर एक समान प्रोटीन टोपोलॉजी लागू करता है के साथ सूचना का आदान प्रदान। एक उदाहरण प्रस्तुत किया है जिसमें एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन, mitochondrial विखंडन फैक्टर (एमएफएफ) के साथ Dynamin से संबंधित प्रोटीन 1 (Drp1) के बीच बातचीत, inve थाइस पाड़ liposome विधि का उपयोग stigated। इस काम में, हम एमएफएफ की क्षमता को कुशलता से liposomes की सतह है, जो अपनी GTPase गतिविधि के लिए प्रेरित करने के लिए घुलनशील Drp1 भर्ती करने के लिए प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, Drp1 विशिष्ट लिपिड की उपस्थिति में एमएफएफ सजाया लिपिड टेम्पलेट tubulate करने में सक्षम था। यह उदाहरण संरचनात्मक और कार्यात्मक assays का उपयोग पाड़ liposomes की प्रभावशीलता को दर्शाता है और Drp1 गतिविधि को विनियमित करने में एमएफएफ की भूमिका पर प्रकाश डाला गया।
Introduction
झिल्ली-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन 1 शामिल अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के देशी पर्यावरण recapitulating में कठिनाई के कारण एक चुनौतीपूर्ण प्रयास है। इस डिटर्जेंट solubilization की आवश्यकता है और proteoliposomes में प्रोटीन की असंगत रुख के कारण है। आदेश में इन मुद्दों से बचने के लिए, हम एक रणनीति है जिसके तहत अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के घुलनशील डोमेन उनकी टैग संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं कार्यरत है, और इन घुलनशील टुकड़े लिपिड पर NTA (नी 2 +) headgroups के साथ बातचीत के माध्यम से पाड़ liposomes के लिए लंगर डाले जाते हैं सतह। इन scaffolds का प्रयोग, लिपिड समीपस्थ प्रोटीन बातचीत लिपिड और प्रोटीन रचनाओं की एक सीमा से अधिक जांच की जा सकती है।
हम प्रभावी रूप से महत्वपूर्ण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत है कि mitochondrial विखंडन परिसर के विधानसभा शासन की जांच और लिपिड बातचीत है कि इस जनसंपर्क मिलाना जांच करने के लिए इस पद्धति लागू की गई हैocess 2। Mitochondrial विखंडन के दौरान, एक संरक्षित झिल्ली remodeling प्रोटीन, Dynamin से संबंधित प्रोटीन 1 (Drp1) 3 बुलाया, सेलुलर संकेत है कि ऊर्जा homeostasis, apoptotic संकेतन, और कई अन्य को विनियमित करने के जवाब में बाहरी mitochondrial झिल्ली (OMM) की सतह के लिए भर्ती किया गया है अभिन्न mitochondrial प्रक्रियाओं। 8 – इस बड़े, साइटोसोलिक GTPase अभिन्न OMM प्रोटीन 4 के साथ बातचीत के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया की सतह के लिए भर्ती किया गया है। एक ऐसे प्रोटीन की भूमिका, mitochondrial विखंडन फैक्टर (एमएफएफ), इन विट्रो में Drp1 के साथ एक स्पष्ट कमजोर बातचीत के कारण स्पष्ट करने के लिए मुश्किल हो गया है। फिर भी, आनुवंशिक अध्ययन स्पष्ट रूप से दिखा दिया है कि एमएफएफ सफल mitochondrial विखंडन 7.8 के लिए आवश्यक है। विधि इस पांडुलिपि में वर्णित एक साथ लिपिड कि बातचीत Drp1-एमएफएफ बातचीत को बढ़ावा देने शुरू करने से पिछले कमियों को दूर करने में सक्षम था। कुल मिलाकर, इस उपन्यास परख reveaमौलिक बातचीत mitochondrial विखंडन परिसर के विधानसभा मार्गदर्शक का नेतृत्व किया और यह आवश्यक आणविक मशीन के चल रहे संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक नया मंच प्रदान की है।
तिथि करने के लिए, Drp1 और एमएफएफ के बीच बातचीत की परीक्षा एमएफएफ 9 के निहित लचीलापन से जटिल कर दिया है, Drp1 की विविधता 2,10 पॉलिमर, और सफ़ाई में और एक अक्षुण्ण transmembrane डोमेन 11 के साथ पूर्ण लंबाई एमएफएफ पुनर्गठन कठिनाई। हम NTA (नी 2 +) पाड़ liposomes का उपयोग कर अपनी transmembrane डोमेन (MffΔTM-अपने 6) की कमी उनकी टैग एमएफएफ पुनर्गठित करने से इन चुनौतियों को संबोधित किया। इस रणनीति लाभप्रद था क्योंकि MffΔTM अत्यंत घुलनशील था जब ई में अधिक व्यक्त। कोलाई, और इस पृथक प्रोटीन आसानी से पाड़ liposomes पर पुनर्गठन किया गया था। जब इन लिपिड टेम्पलेट्स के लिए सीमित, एमएफएफ झिल्ली की सतह पर एक समान, जावक का सामना करना पड़ उन्मुखीकरण ग्रहण किया।इन फायदों, इस तरह के रूप में cardiolipin mitochondrial लिपिड, के अलावा, झिल्ली 11 के साथ MFF तह और संघ को स्थिर करने के लिए जोड़ा गया था। Cardiolipin भी Drp1 2,12 के चर डोमेन जो इस अव्यवस्थित क्षेत्र को स्थिर करने और विखंडन मशीनरी के विधानसभा सुविधा हो सकती है के साथ सूचना का आदान प्रदान।
यह मजबूत विधि भविष्य के अध्ययनों कि झिल्ली समीपस्थ प्रोटीन बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए की तलाश के लिए व्यापक रूप से लागू है। अतिरिक्त टेदरिंग / आत्मीयता के बातचीत के उपयोग के माध्यम से, इन झिल्ली पुनर्गठन के अध्ययन का परिष्कार कोशिकाओं के भीतर की झिल्ली की सतह पर पाया अतिरिक्त जटिलता नकल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इसी समय, लिपिड रचनाओं अधिक सही इन macromolecular परिसर के देशी वातावरण नकल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। सारांश में, इस विधि रिश्तेदार महत्वपूर्ण सेलुलर proc के दौरान झिल्ली morphologies को आकार देने में प्रोटीन का योगदान और लिपिड जांच करने के लिए एक साधन प्रदान करता हैesses।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल प्रोटीन, प्रोटीन अभिन्न झिल्ली प्रोटीन को शामिल बातचीत की जांच के लिए एक तरीका प्रदान करता है। एक मॉड्यूलर liposome पाड़ उपयोग करके, जांचकर्ताओं को एक लिपिड समीपस्थ वातावरण में एक या एक से अधि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
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