الببتيد المستمدة من طريقة لنقل الجينات والبروتينات عبر الخلوي والحواجز Organellar في النباتات
Summary
Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.
Abstract
The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.
Introduction
Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتناقش الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي تم التعرف تجريبيا. تسلل حقنة، وعرض الصيغ القائمة على الببتيد في الأجواء داخل أوراق النبات من خلال الثغور. لضمان امتصاص القصوى من الحل، يجب إجراء عملية تسلل خارجا عندما النباتات تحت ظروف تؤدي إلى فتح الثغور أي.، مع توفير ما يكفي من المياه وذلك خلال الفترة الخفيفة. وفيما يتعلق إعداد مجمعات ترنسفكأيشن، لتركيبات التي تنطوي على مزيج من اثنين من الببتيدات (لاستهداف الميتوكوندريا تسليم DNA)، وتسلسل لإضافة كل عنصر بالغ الأهمية، وينبغي ألا مقلوب.
هناك العديد من التعديلات معقولة لهذا الإجراء. خيار آخر للتسلل خلايا النبات هو استخدام تسلل الفراغ، التي هي قادرة على تقديم حل معقد إلى النباتات الكاملة و / أو الأنسجة جزئية بما في ذلكالخلايا الإنشائية قمي. لهذا الإجراء البديل، وغرقت الشتلات في حل ترنسفكأيشن، وبناء على ضغط الناتجة عن الفراغ، وأجبرت المجمعات الببتيد البضائع عبر الثغور وفي الخلايا النباتية (Yoshizumi، T.، بيانات غير منشورة).
التعبير الجيني عابرة، بناء على الدراسات التي تستخدم الخلايا الحيوانية، وقد تبين لزيادة مع ارتفاع تركيز الحمض النووي 29-31. من المهم أن نلاحظ أن نسبة الببتيد إلى الحمض النووي يؤثر على الخصائص الفيزيائية الحيوية (الحجم، وتهمة السطحية) من المجمعات (الشكل 4)، الأمر الذي يؤثر كفاءة ترنسفكأيشن. وبالتالي، يجب على النسبة المثلى أن يستمر حتى مع زيادة تركيز الحمض النووي.
واحدة من المزايا الرئيسية في استخدام الببتيدات كعامل توصيل الجينات / البروتين هو أن تسلسله هو قابل للضبط على الوفاء الوظيفة المطلوبة. على سبيل المثال، المجال استهداف الميتوكوندريا من الببتيد الناقل وصفها في هذا مسمارذ يمكن استبدالها مع تسلسل chloroplastic أو استهداف peroxisomal لتوطين هذه العضيات. في حين تحول بلاستيدات الخضراء ممكن في العديد من المصانع التي تستخدم biolistics 32-34، يمكن أن أيا من الأجرعية ولا طريقة biolistic إدخال جينات وراثية في الميتوكوندريا أو عضيات أخرى إلى جانب النواة (الجدول 2).
لا توجد قيود المضيف مجموعة جامدة لترنسفكأيشن القائم على الببتيد، على عكس طريقة المستندة الأجرعية (الجدول 2). وحتى الآن، تركيبات لترنسفكأيشن من A. thaliana، N. benthamiana والحور وقد تم تحسين (الجدول 1)، ولكن يمكن أيضا أن تطبق أسلوب النيكوتين تبغ، نباتات الطماطم الصغيرة توم والأرز (على أساس التجارب الأولية)، وغيرها من النباتات أحادية وذوات الفلقتين.
حتى الآن، ليس هناك قيود معروفة في حجم التحوير عند استخدام الببتيدات لناقلات الصورة ترنسفكأيشن. في المقابل، تم العثور على جزيئات الحمض النووي كبيرة للحد من كفاءة تحويل الأجرعية طرق بوساطة 35،36، والحد الأقصى لحجم العلوي لالجينات المحورة ما يقرب من 200 كيلو بايت تم الإبلاغ 37-39. باستخدام biolistics، من ناحية أخرى، قد تكون المنفصمة شظايا الحمض النووي كبيرة أثناء إعداد أو تسليم في النباتات 38. على الرغم من عدم الحد الأعلى وقد تم تحديد التحول biolistic حتى الآن، تم العثور على القيود المادية لتقييد حجم الحمض النووي التي يمكن نقلها إلى أقل بكثير من 150 كيلو بايت 40. الفوائد الرئيسية لاستخدام النظام القائم على الببتيد لنقل الجينات بالمقارنة مع النهج القائمة توظيف إما الأجرعية أو قصف microprojectile، التي نوقشت أعلاه، وتتلخص في الجدول 2.
وجود عدد قليل من القيود لهذا الأسلوب كما هو عليه. أولا، تستهدف تقديم PDNA إلى العضيات محددة، مثل معهد ماساتشوستس للتكنولوجياochondria، وقد ثبت ذلك ممكنا من خلال مزيج بسيط من، متواليات اختراق الخلية وعضية العبور ملزم الحمض النووي على الرغم من أن الكفاءة كانت منخفضة. يمكن أن يتم الكشف عن التعبير التحوير، من خلال الفحص المجهري متحد البؤر، إلا في عدد قليل من السكان الميتوكوندريا في الخلايا. وبالتالي، هي مزيد من التعديلات اللازمة ل: (ط) تعزيز النبات من أكثر المجمعات عبر الخلية / غشاء organellar، و (ب) تحسين التفكك ونقل PDNA من الببتيد الناقل في العضية المستهدفة للتعبير. ثانيا، وذلك باستخدام هذا النظام تسليم الحمض النووي، وقد تحقق التعبير عابرة من الجينات مراسل خارجية بنجاح في مقصورة عصاري خلوي والميتوكوندريا من الخلايا. لم يثبت التأسيس مستقر والتعبير عن الجينات التي أدخلت في محطة نووية / الجينوم organellar بعد، ولكن نظرا لعدم وجود استراتيجيات اختيار مناسبة.
ومع التسليم بأن هناك مجالات للتحسين أو مزيد من دevelopment، الاستراتيجية المستمدة من الببتيد هو موضح هنا تبقى تقنية بسيطة وتنوعا الذي مهد الطريق لتسليم البضائع المختلفة إلى أنواع النباتات المتنوعة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف بتمويل من اليابان العلوم واستكشافية بحوث التكنولوجيا وكالة للتكنولوجيا المتقدمة (JST-ايراتو)، والطاقة الجديدة والتكنولوجيا الصناعية منظمة التنمية (نيدو)، وبرنامج تعزيز الابتكار الاستراتيجي عبر الوزاري (SIP)، اليابان .
Materials
| (KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
| (BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
| BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
| Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
| P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
| pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
| dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
| GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| 1 mL and 10 mL Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
| 96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
| Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
| Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
| Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
| Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
| Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
| Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
| Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
| Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
| Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
| Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
| Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
| Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
| Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
| Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
| Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
| Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
| Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
| Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
| Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
| Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
| Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |
References
- Altman, A., Hasegawa, P. M. . Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , (2011).
- Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
- Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
- Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
- Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
- Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria–a rare event?. FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
- Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K., Cai, W. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. , 667-689 (2014).
- Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
- Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
- Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
- Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
- Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
- Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
- Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
- Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
- Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751 (2015).
- Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. Plant transformation method. Patent. , (2015).
- Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).
- Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
- Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
- Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
- Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
- Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
- Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
- Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
- Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
- Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
- Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
- Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
- Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).
- Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
- Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).
