여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.
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방법 논문
양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus
이 논문에서
요약
초록
유전체학의 발전으로 전례 없는 규모로 생물 다양성을 조사할 수 있는 가능성이 높아졌습니다. 그러나 염기서열만으로는 유전자 기능을 연구할 수 있는 도구 없이는 정보를 얻을 수 없습니다. 따라서 실험실에서 새로운 모델 시스템을 구축하고 기능 연구를 수행하기 위한 도구를 위한 세부 프로토콜의 개발 및 공유는 유전체학의 힘을 활용하는 데 매우 중요합니다. 딱정벌레목(딱정벌레)은 곤충의 가장 큰 군집이며 지구상의 거의 모든 유형의 서식지를 차지합니다. 기초 연구를 위한 이상적인 모델을 제공하는 것 외에도 딱정벌레에 대한 연구는 종종 가정, 농업 및 식품 산업의 해충이기 때문에 해충 방제에 영향을 미칠 수 있습니다. D. maculatus 실험실 군체의 사육 및 유지 관리와 D. maculatus에서 dsRNA 매개 간섭을 수행하기 위한 자세한 프로토콜이 제시됩니다. 장치 설정, 준비, 주입 및 주입 후 회복을 포함한 배아 및 부모 RNAi 절차가 모두 설명됩니다. 또한 생존력, 부화한 유충의 패턴 결함, 부화하지 않은 유충에 대한 큐티클 준비를 포함한 배아 표현형을 분석하기 위한 방법도 제시됩니다. 이러한 분석은 분자 마커에 대한 현장 혼성화 및 면역 염색과 함께 D. maculatus를 기초 및 응용 연구를 위한 접근 가능한 모델 시스템으로 만듭니다. 또한 다른 새로운 곤충 모델 시스템에서 절차를 수립하는 데 유용한 정보를 제공합니다.
서론
1998 년 화재와 멜로는 이중 가닥 RNA (dsRNA를이) 예쁜 꼬마 선충 1 유전자 기능의 억제를 유도 할 수 있다고보고했다. dsRNA에 의해 유발이 반응은 RNA 간섭 (RNAi의) 명명하고, 이러한 RNAi를 매개 된 유전자 사일런 싱은 동물, 식물, 균류 및 2-7에서 보존되는 것으로보고되었다. 일부 식물 및 동물에서의 RNAi 기능 전신적 의미 효과 (8-10에서 검토) dsRNA를 직접 도입되지 않은 다른 세포 / 조직으로 확산 될 수있다. 과학자하여 직접 (11-14에서 검토) 게놈을 조작없이 유전자 기능을 쓰러 뜨린, 관심의 유전자를 대상으로 dsRNA에를 설계하여이 내생 세포의 RNAi 응답의 사용을 만들었습니다.
RNAi의는 다음과 같은 장점으로 인해 기능 연구를위한 강력한 도구입니다. 먼저도 최소한의 유전자 서열 정보하는 유전자의 RNAi를 사용하여 타겟팅 될 수있다. 이 일에 특히 중요하다게놈 또는 transcriptomic 데이터가없는 비 모델 생물의 udies. 둘째, RNAi의 응답이 견고 전신 인 유기체에서 RNAi를 매개하는 유전자 녹다운 거의 모든 발육 단계에서 수행 될 수있다. 이 기능은다면 발현 유전자의 ....
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프로토콜
D. maculatus 1. 부양
참고 : D. maculatus의 번식 식민지는 성인을 사용하여 저자의 실험실에서 설정하고 유충은 상업적으로 구입했다. 종 ID는 DNA 바 코딩 (53)을 이용하여 확인 하였다.
- 실험실에서 새 케이지를 설정하려면, 중간 크기의 곤충 케이지 (30.5 X 19 X 20.3 cm 3)에 나무 부스러기의 얇은 층을 확산. 번데기에 대한 애벌레 숨기기 수 있도록 케이지에 스티로폼의 ~ 10 × 6 × 3cm 3 덩어리를 놓습니다. (50) 딱정벌레 (성인이나 늦은 령 유충 중) - (20)를 추가합니다. 딱정벌레는 나무 부스러기에 숨어 있습니다.
- 페트리 접시 또는 무게 보트에 젖은 고양이 음식을 추가합니다. 메쉬 천으로 케이지를 덮고 인큐베이터에 케이지를 놓습니다.
- 실험실에서 사육 식민지를 유지, 25 및 30 °의 C 사이의 온도를 설정합니다. D. maculatus 빠르게 고온에서 성장하지만, 이것은 또한 곰팡이 및 진드기의 성장을 촉진한다. 치유를 유지하기 위해빠르게 식민지를 확장하기위한 정기적 인 재고 유지 보수 및 30 ° C, 28 ° ....
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결과
저자의 실험실은 곤충 53, 55의 분할을 조절하는 유전자의 기능 진화를 연구하는 RNAi의 기술을 사용하고있다. 모든 곤충이 분할되어 있지만, 이러한 과정을 조절하는 유전자를 곤충 방사선 26,38,56-63 동안 갈라 것으로 보인다. 초파리 유전자 스크린 바디 세그먼트 64-70의 형성을 촉진하는 책임 아홉 쌍 룰 분할 유전자 세트를 식별. 여기서, 이들 유전자 중 하나의 ortholog, 쌍 (PRD)은, D. maculatus에서 유전자 기능을 연구하기위한 RNAi에의 유용성을 문서화하는 데 사용됩니다.
이 종에서 세그먼트 형성 PRD - eRNAi 및 pRNAi 각 DMAC의 역할을 보여주는에 효과.......
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토론
정교한 모델 시스템 (마우스, 날아 벌레)의 소수는 20 세기 동안 개발 동안, 21 세기 새로운 동물 시스템의 물결이 전 세계에 걸쳐 연구실에서 개발중인 보았다. 이 새로운 시스템은 과학자 만 '표준'모델 시스템을 사용하여 탐색 할 수 없습니다 비교, 진화의 문제를 해결 할 수 있습니다. 새로운 모델이 배포 실험실 배양, 유전자 식별 및 새로운 종의 기능적 접근 방법의 급속한 발전이 필요합니다. 여기에서, 실험실 및 배아의 RNAi, 부모의 RNAi,이 딱정벌레의 표현형 분석을위한 단계별 프로토콜에 D. maculatus를 양육하기위한 절차를 제시 하였다. 목표는 이러한 설명은 자신의 실험에서 D. maculatus을 사용하고 추가로 새로운 모델 종을 개발하기 위해 여기에 제시된 방법을 사용하기 위해 다른 사람을 격려한다는 것입니다.
D. maculatus 리터 동안AB 식.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
미세 주입 장치를 설치하고 곤충 RNAi에 대한 귀중한 지식과 경험을 공유해 주신 Alison Heffer 박사와 Yong Lu 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 지원을 받았습니다(R01GM113230 to L.P.).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dermestes maculatus 살아있는 딱정벌레 | 우리 실험실 또는 Carolina Biological Supply | #144168 | 우리 실험실 균주는 COI 바코드로 확인되었습니다. 캐롤라이나의 균주 변동을 배제할 수 없습니다 |
| 젖은 고양이 사료 | Fancy Feast | 그레이비를 곁들인 고기 덩어리. 대부분의 애완 동물 사료 및 식료품 점에서 구입할 수 있습니다 | |
| 건조 개 사료 | Purina Puppy Chow | 대부분의 애완 동물 사료 및 식료품 점에서 구입할 수 있습니다 | |
| 곤충 케이지 (중 크기, 30.5 x 19 x 20.3cm) | Exo Terra | PT2260 | 식민지 유지 보수용. 필요한 경우 더 큰 케이지를 사용할 수 있습니다 |
| 곤충 케이지 (미니 크기, 17.8 x 10.2 x 12.7cm) | Exo Terra | PT2250 | 배아 수집 |
| 용 페트리 접시 | VWR | 89038-968 | |
| 면봉 | Fisher | 22-456-883 | |
| Megascript T7 전사 키트 | Fisher | AM1334 | 40 회 반응 |
| 용 공압 펌프 | WPI | PV830 | |
| 모세관 홀더 | WPI | ||
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| 검정 여과지 (90 mm) | VWR | 28342-010 | |
| 식용 색소(녹색) | McCormick | ||
| 붕규산 유리 모세관 | Hilgenberg | 1406119 | |
| 니들 풀러(마이크로피펫 풀러) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 현미경 유리 슬라이드 | WorldWide Life Sciences Division | 41351157 | |
| 밀봉 필름 (Parafilm M) | Fisher | 13-374-12 | |
| 모델 801 주사기 (10 &마이크로; l) | Hamilton | 7642-01 | |
| 바늘 (32게이지) | Hamilton | 7762-05 | |
| 정착 솔루션(Pampel's) | BioQuip Products, Inc. | 1184C | 유독성, 흄 후드에서 취급해야 |
| 집게 (DUMONT #5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader 피펫 팁 | Fisher | E5242956003 | |
| 배아 주입용 해부 현미경 | Leica | M420 | |
| 유충 표현형 시각화를 위한 현미경 해부 | Zeiss | SteREO Discover. V12 | |
| DIC 현미경 Zeiss | AXIO 이미저. 엠1 |
참고문헌
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in....
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재인쇄 및 허가
