リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール<em>インビボ</emヒト骨格筋における>ミトコンドリア酸化的リン酸化能力

Summary

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Abstract

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo ³¹PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. ³¹PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for ³¹PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Introduction

この作業の目的は、非侵襲的な能力の広い範囲を有する個体においてin vivo骨格筋ミトコンドリア機能に測定するための再現性のある方法を概説することです。異常なミトコンドリアの機能障害は、そのようなフリードライヒ失調症などの稀な疾患への老化や糖尿病などの一般的な条件から、メタボリックシンドロームや遺伝性疾患の広い範囲の特徴です。

メタボリックシンドロームとミトコンドリア機能障害

メタボリック症候群は、ミトコンドリアの機能を破壊骨格筋OXPHOSを押し下げ、および骨格筋^1、2における異所性脂質貯蔵をもたらすことが示されています。代謝およびエネルギー恒常性を調節する重要な細胞小器官として、ミトコンドリアは肥満^3,4の病態生理に関与している、インスリン抵抗性⁵ </sup>、2型糖尿病^{（T2DM）6、7、}糖尿病関連微小^{8、9、10、11}および大血管合併症^12,13、および非アルコール性脂肪肝疾患^{（NAFLD）14、15、16、}とりわけO ₂酸化還元酵素活性を^5：抵抗.Insulinミトコンドリアのトリカルボン酸（TCA）流動速度、ATP合成速度、およびクエン酸シンターゼおよびNADHの減少を含む骨格筋ミトコンドリア活性における重大な変化によって特徴付けられます。 1つの仮説は、これらの変化が著しく、肥満および他の肥満rの間に増強された筋肉中の遊離脂肪酸（FFA）代謝産物の蓄積、に起因するかもしれないということです得意疾患^2、17。高架のFFAおよび脂質中間体への筋の暴露は、脂質の酸化経路における遺伝子の発現だけでなく、TCAサイクルと電子輸送チェーン^{（ETC）18を}減少^させることができます。脂質の過負荷の設定におけるミトコンドリア骨格筋OXPHOS容量のこの減少は、定量的（ミトコンドリアの内容及び生物発生）の減少¹⁹と骨格筋ミトコンドリア²⁰の定性的な機能を伴っています。 FFAに骨格筋や心筋細胞を公開する重度のインスリン抵抗性をもたらし、筋肉で増加したFFAの取り込みは、ヒトおよびげっ歯類²¹の両方におけるインスリン抵抗性と関連しています。脂質中間体セラミドおよびジアシルグリセロール（DAG）は、プロテインキナーゼCおよびPROTとして、直接のキナーゼの活性を変化させることにより、インスリンシグナル伝達経路を阻害することが示されていますEINキナーゼB ^21。したがって、脂質由来分子は、骨格筋のインスリン抵抗性およびT2DMの発症において重要な役割を果たすように思われます。しかし、ミトコンドリアの容量の変化が原因またはインスリン抵抗²²の結果であるかどうかは不明のままです。

フリードライヒ失調症およびミトコンドリア機能障害

減少OXPHOSはまた、遺伝的欠陥から生じ得ます。フリードリッヒ運動失調（FA）、遺伝性運動失調症の最も一般的な形態は、ミトコンドリア内鉄蓄積、活性酸素種の産生をもたらすフラタキシンにおける突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患（FXN）遺伝子であり、酸化的リン酸化²³の異常^{、 24、25、26。}この重要な発見はwhic、標的治療の開発につながりましたHの目的は、サブ細胞レベルでのミトコンドリア機能を改善します。この理解にもかかわらず、in vivoでの限られた開発、FA臨床研究のための再現性のあるバイオマーカーがありました。実際には、FAにおける標的療法の効果的な評価に重要な障壁は、ミトコンドリア機能の変化を追跡することができないことです。現在の機能的手段は、例えば、心拍出量の減少を識別することができます。しかしながら、それらは、機能不全が起こるレベル（ 図1）を決定することができません。識別し、フリードリッヒ運動失調における疾患の進行を評価するために使用され得るミトコンドリア機能の信頼できるマーカーの開発は、標的療法の関連する機械的影響を評価することが重要です。

減損OXPHOSと心機能不全

異常なミトコンドリア機能、のいずれかの取得または遺伝的には、カルディの発症または進行に寄与し得ます交流機能不全。圧負荷および心不全の条件下では、FFAの一次エネルギー基質優先スイッチがグルコースします。これは、減少したETC活性および酸化的リン酸化²⁷に関連しています。心機能障害におけるミトコンドリアの生体エネルギーの病態生理は、ミトコンドリアの欠陥の主な起源に応じて異なる場合があります。糖尿病および還元基板の柔軟性、エネルギー効率、および最終的には、拡張機能障害^28、29につながるような障害の生合成及び脂肪酸代謝のような心筋におけるミトコンドリア異常、代謝症候群をもたらします。心筋細胞^30、31の大幅なミトコンドリアの鉄蓄積でFAで、一方、フラタキシン欠乏の結果。鉄蓄積は^、<フェントン反応^32を介してフリーラジカルの産生をもたらします/ SUP>とフリーラジカル誘発性心筋損傷の可能性が高くなります。ミトコンドリア内鉄蓄積はまた、酸化ストレスに対する感受性の増加および減少の酸化容量^30、31に関連しています。フラタキシン欠乏に起因する鉄蓄積とそれに続く異常なミトコンドリア機能は、したがって、FA ^33、34で観察された損なわれた心臓のエネルギー特性や心筋症を担当することがあります。骨格筋のミトコンドリア中の還元酸化能力は、運動不耐性に匹敵し、心不全^（HF）35で代謝能を低下させたことに注目することも興味深いです。骨格筋OXPHOS容量の測定は、本明細書に詳述するように、容易に実現可能で堅牢です。 HFにおける骨格筋OXPHOSの重要性と相まって、これらの機能は、それ聞くの総合的な研究における魅力的なバイオマーカー作りますトン病^36。

減損OXPHOS及び添付の心機能不全は、代謝およびミトコンドリア病の取るに足らない態様ではありません。糖尿病および代謝性疾患を有する対象は、心血管疾患を発症するリスクが高いと心筋梗塞^{（MI）37、38、39、40、41}後の超過死亡率を持っています。 FAの半分以上の被験者は、心筋症、および心臓不整脈や心不全⁴²の多くのダイを持っています。したがって、縮小OXPHOSの定量化は、心機能障害の早期発見と治療のための可能性だけでなく、これらの疾患における主要な臨床負担を軽減することができます。

直接OXPHOS容量を増加させる標的療法は、WHE、対象の治療を改善するための有望な領域でありますTHER代謝機能不全の原因は、遺伝的または後天性です。現在、異常なミトコンドリア機能^43を軽減またはプライマリ遺伝的欠陥^44を修正いずれかの新たな標的薬の開発は、FAの錯乱生体エネルギー特性を向上させることができます。取得されたミトコンドリア機能不全の場合には、増大した身体活動は、機能^{45、46、47、}ミトコンドリアを向上させることができます。

ミトコンドリア機能の非侵襲的バイオマーカーとして³¹リン磁気共鳴分光法

かかわらず、試験された治療の、骨格筋の生体エネルギーのin vivo評価に統合され、特に重度の運動不耐性または従来のメタボを受けることができないの被験者に、対象となる介入の影響を評価するための重要なツールです。LICのテスト。体全体の細胞内リン^（31 PMRS）に同調磁気共鳴分光法、さまざまな高エネルギー基質に見出される内因性の核は、で磁石の運動回復プロトコルを含む、様々なアプローチを用いて、ミトコンドリアの酸化的能力を定量化するために使用されてきたと筋肉刺激プロトコル^48。運動回復プロトコルは規制し、バースト型抵抗と準静的な運動を可能にするストラップとパッドのシンプルな構成にワークロードを測定MRI対応エルゴメーターから複雑で測距装置の様々に依存しています。これらのプロトコルのいずれかの主要な目標の一つは、アデノシン三リン酸（ATP）の需要が最初にクレアチンキナーゼ反応^49を介してホスホクレアチンの酵素的分解法（PCR）を介して満たされているエネルギーの不均衡を生成することです。運動の停止時に、ATP産生の速度は、酸化フォーによって支配されますsphorylationとは、ミトコンドリア⁵⁰の生体内容量の最大値を表します。また、運動後の回復中OXPHOSは、一次速度反応⁵¹により説明することができます。 PCRを運動後の回復は、したがって、酸化ATP合成のためのより大きな能力を表す_τPCRを小さい値を有する指数関数の時定数_（τPCR）をフィッティングすることによって定量することができます。重要な努力が³¹ ex vivoでに対するPMRSとOXPHOSのより直接的な対策を検証し、この手法^{52、53、54、55}の潜在的な臨床適用性を実証するために行われてきました。

注目すべきことに、この研究で説明されたプロトコルは、臨床的に利用可能なスキャナ上で実施することができ、広く非侵襲性バイオマーカーのOとして確認されていますFミトコンドリア機能^56。しかし、神経筋障害や移動度の変化する重大度を持つ個人への適用のために最適化された運動³¹ PMRSプロトコルは、よく^57を確立されていません。明確に定義され、広く-該当する運動プロトコルと³¹ PMRS技術は、ミトコンドリア機能の基本的な異常を伴う疾患の評価に特に有用であろう。

いくつかの先行研究では、被験者におけるミトコンドリア機能を定量化するために非侵襲的技術の応用を検討しています。例えば、これらの技術は、2型糖尿病の³⁶の被験者における障害OXPHOSを示しています。ロディら。最初のFAを有する被験者にPMRS技術の実現可能性をテストし、1）FAにおける基本的な遺伝的欠陥は、骨格筋OXPHOSを損ない、2）GAAトリプレットの数が繰り返され、骨格筋Oに反比例することがわかりましたXPHOS ^33。より最近では、Nachbauer ら。 7科目とFAの治験における二次アウトカム指標としてPMRSを使用していました。 PCr回復時間はロディの初期の作品を再確認し、FAでの異常なフラタキシン発現の効果がPMRS技術^58を使用して検出可能であるミトコンドリア能力の低下をもたらすことができることを示す、対照と比較して、被験者において有意に長かったです。

信頼性の高い方法は十分に実現可能な、費用対効果、および再現可能な方法で生体内骨格筋の機能に定義するためには、ミトコンドリアの機能に影響を与える疾患の範囲の主題転帰を改善するために重要です。

この作品は³¹ PMRSを使用して、骨格筋の生体内最大酸化能力に取得するための堅牢な手順の概要を説明します。内磁石運動プロトコルはよく物理的および関数Aの広い範囲にわたる個人によって許容されますリットルの能力と安価で広く入手可能な装置を使用して簡略化された対象のセットアップを与えます。

Protocol

このプロトコルは、によって承認され、人体実験のためのオハイオ州立大学施設内倫理委員会のガイドラインに準拠しています。 MR装置に関連するすべての手順は、MRの安全性59の最高水準に付着十分に訓練を受けた要員によって実行されることが非常に重要です。 1.材料と準備すべての必要な材料は、実験前（ 図2）に利用可?…

Representative Results

再現性の研究 六人のボランティア（男性4人と女性2人、平均年齢：24.5±6.2歳）なし自己報告心臓、代謝、またはミトコンドリア病とは、技術を評価するために、1週間以内に2別の日に説明した31 PMRS運動とイメージング技術のセッションを受けました再現性（ 図6a）。正常なボランティア?…

Discussion

本稿では、骨格筋ミトコンドリア機能のシリアルおよび非侵襲的in vivoでの測定を提供する³¹ PMRSの検査のための標準プロトコルを記述しています。メタボリックシンドロームとその結果の罹患率および死亡率の増加負担を標的捜査の幅を考慮した場合、プロトコルは、かなりの魅力を保持しています。この³¹ PMRSプロトコルは、スキャナ最小限の時間を必要とし、市販の…

Materials

1.5 T MR Scanner	Siemens		manufacturer will not affect results
10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible	PulseTeq		manufacturer will not affect results
3 fl oz Baby Oil	Johnson & Johnson		manufacturer will not affect results
Foam triangle cushion (Knee)	Siemens		manufacturer will not affect results
(3) plastic buckle resistive straps; table to table	Siemens		manufacturer will not affect results
(1) plastic buckle resistive strap; self-connecting	Siemens