파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.
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방법 논문
RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인
이 논문에서
요약
초록
파킨슨 병 (PD)에서 운동 완만, 강성 및 진동에지도하는 SNC에서 도파민 뉴런의 발음 변성 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실이있다. 형광 마커를 사용하여 기본 복부 중뇌 (VM) 문화 생활 도파민 신경 세포의 식별은 고정 된 세포의 면역 염색에 의존하지 않고 이러한 신경 세포의 선택적 취약점을 연구하는 다른 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 분리, 해리, 문화 마우스 VM 신경 삼주합니다. 우리는 그 다음의 (a 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터에 의해 구동) eGFP는 형광을 이용하여 문화에서 도파민 신경 세포를 식별합니다. 개별 뉴런 유리 가능한 Micropipette를 사용하여 마이크로 원심 튜브에 수확된다. 다음으로, 우리는 수확 된 세포 용균 및 단일 세포 RNA-SEQ 라이브러리 (1, 2)를 생성하는 cDNA 합성 및 트랜스포존 매개 "tagmentation를"행위엉덩이 = "외부 참조"> 3, 4, 5. 품질 제어 검사를 통과 한 후, 단일 셀 라이브러리는 서열화되고 후속 분석은 유전자 발현을 측정하기 위해 수행된다. 우리는 개인의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 사체 결과를보고한다. 우리는 수확 서열 된 라이브 TH-eGFP는 세포의 100 % 도파민 신경 세포라고보고한다. 이러한 기술은 신경 과학 및 분자 생물학에서 광범위하게 응용 프로그램을 제공합니다.
서론
파킨슨 병 (PD)는 불치, 노화와 관련된 퇴행성 신경 질환이다. 이 비교적 흔한 질환의 원인은 제대로 이해 남아 있습니다. 운동 완만, 강성 및 진동의 진단 임상 양상에 이르는 Substantia 그라 (SNC)에서 도파민 뉴런의 뚜렷한 신경 세포의 변성과 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실은있다.
SNC의 도파민 신경 세포를 포함하는 차 혼합 문화는 파킨슨 병에 특히 적합하다. 복부 피개 영역 (VTA) 도파민 뉴런은 보상과 중독에 연루되어있다. 복부 중뇌 (VM) 차 혼합 배아 문화 SNC와 VTA의 도파민 (DA) 신경 세포와 GABA 성 신경 세포 모두를 포함한다. VM 일차 배양 신경 분석에 유용 할 수 있고, 도파민 성 신경 세포의 선택적 취약점 해명. 형태에 따라 문화에서 도파민 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법은 없습니다. 그우리는 단일 셀, 고 수율 RNA 시퀀싱 라이브러리를 식별하고 하나의 도파민 신경 세포를 수확하고 구성하는 기술을 개발 재.
우리는 하나의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 대표의 RNA 전 사체 데이터를보고합니다. 이 프로토콜은 DA / GABA 사체의 다양한 치료법의 효과를 연구하기 위해 신경 보호, 신경 퇴....
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프로토콜
참고 : 모든 실험 관리 및 국민 건강의 연구소 및 프로토콜에서 제공하는 동물의 사용에 대한 지침에 따라 수행 하였다는 캘리포니아 공과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
배아 마우스 뇌에서 차 도파민 세포 배양 1. 유도
- 솔루션 및 문화 매체
- 아스 코르 산 원액의 제조
- 아스코르브 산 352 mg의 칭량. 20 ㎖의 최종 총 부피에 멸균 H 2 O를 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 넣어 용해합니다. -20 ° C에서 500 μL 씩 0.2 μm의 주사기 팁과 저장소를 통해 필터링합니다.
- 파파인 원액의 제조
- 15 단위 / 1 배 Hanks' 균형 소금 용액 ㎖ (HBSS)에 파파인을 희석. 최대 피펫 5 배 아래로 철저하게 혼합 할 수 있습니다. 해부의 날에 준비합니다.
- DNase의 원액의 제조
- DNase의 20 밀리그램을 달아. 20 ㎖의 총 최종 부피에 멸균 H 2 O를 추가합니다. 0.2 μm의 주사기 필터 팁 살균 필터. 1 mL의 분취 량에서 -20 ° C에서 보관.
- 아스 코르 산 원액의 제조
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결과
여기에서 우리는, 티로신 수산화 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-SEQ (그림 1)를 사용하여 자신의 RNA 전 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다. 데이터 수확 서열화 된 TH-eGFP는 양성 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체의 존재 TH, DOPA 데카 복실 라제 (DDC) 및 도파민 전달체 DAT에 기초하여, 도파민 뉴런 것으로 나타났다 (slc6a3). RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 각각의 단일 셀 RNA-서열 라이브러리에서 6,000 - 8,000 단백질 코딩 유전자 (그림 2) 검출되었다. 도파민 신경 세포는 견고 여러 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (nAChR을) 서브 유닛 (표 1)에
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토론
여기에서 우리는 단일 셀 RNA-서열과 각 셀을 연구, 형광 태그를 사용하여 이기종 인구에서 단일 세포를 분리. 우리는 수확 서열 라이브 TH-eGFP는 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체, TH, DDC 및 slc6a3의 존재에 기초하여, 실제로 도파민 뉴런 있다고보고한다. RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 이는 각각의 TH-eGFP는 세포는 도파민 뉴런 (8, 9)와 연관된 이온 채널의 레퍼토리를 표시되었습니다 전기 생리학 연구와 일치율이었다. 이 프로토콜에서 우리는 라이브 도파민 신경 세포에 대한 신뢰할 수있는 표식으로 GENSAT 티로신 수산화-eGFP는 마우스 스트레인 (10)를 이용했다. WT 문화에서 현재 자신의 형태를 기반으로 라이브 도파민 신경 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법이 없습니다........
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(DA017279, AG033954, DA037743), 마이클 J. 폭스 재단, 캘리포니아 공과대학의 밀라드 앤 뮤리엘 제이콥스 유전학 및 유전체학 연구소에 자금을 지원하는 칼텍 혁신 이니셔티브의 보조금으로 지원되었습니다. RNA-Seq 라이브러리 프로토콜을 최적화하고 도움을 주신 Brian Williams에게 감사드립니다. 컴퓨터 교육에 대해 Henry Amrhein에게 감사드립니다. Barbara J. Wold가 자신의 장비와 실험실 공간을 사용해 준 것에 대해 감사드립니다. 도서관 염기서열 분석과 시설 관리에 대해 Igor Antoshechkin에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 파파인 | 워딩턴 생화학 공사 | ||
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| 기증자 말 혈청 | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 시그마 | A7030-50G | |
| 매체: Neurobasal 매체 | Gibco | 21103-049 | |
| L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민의 안정화된 형태를 포함하는 배양 배지: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5mM 최종 농도. |
| L-아스코르브산 | 시그마 | A7506 | |
| B27 | 기코 | 17504-044 | 50x 스톡 용액, 1x 최종 농도. |
| 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| 폴리-L-오르니틴 | 시그마 | P4957 | |
| 라미닌 | 시그마 | L2020 | -20 °에 저장되었습니다. C 20 & 마이크로; L 분취량 |
| 데옥시리보뉴클레아제 I (DNase) | 시그마 | DN25 | |
| 블루 피펫 팁 P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm 얕은 페트리 접시 | VWR | 25384-324 | |
| 37 ° C 수조 | |||
| 37 ° C, 5% 습도 인큐베이터 | |||
| 16% 파라포름알데히드(PFA) | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | X100-500ML | |
| 당나귀 세럼 | 에퀴테크 | SD-0100HI | 100% 원액, 1% 최종 농도. |
| 표준 패턴 수술용 가위 | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps - 2x3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco의 인산염 완충 용액 (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G 바늘 | BD PrecisionGlide 바늘 | 305167 100 바늘 | |
| 마이크로피펫 풀러 | 서터 기기 | 모델 P-87 | |
| 마이크로매니퓰레이터 | 셔터 기기 | MP-285 | |
| 염기서열분석 키트: Illumina 염기서열분석을 위한 SMARTer 초저 RNA 키트 | Clontech | 634936 100 rnxs, incl Advantage2PCR Kit | |
| 올리고뉴클레오티드 (12 µ M): SMARTer IIA 올리고뉴클레오티드(12 µ M) | SMARTer 키트에서 | ||
| 역전사효소 (100 units) | SMARTcribe 역전사효소 | SMARTer Kit에서 | |
| 프라이머 1 | 3' CDSIIa 프라이머 | SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR 프라이머 | 에서 SMARTer Kit | |
| 50x 2 중합효소 혼합물 | 50x Advantage 2 중합효소 혼합물 | SMARTer Kit에서 | |
| 10x PCR buffer | 10x Advantage 2 PCR buffer | ||
| RNA 스파이크 | ThermoFisher 4456740 | ||
| PCR 쿨러 랙 | IsoFreeze PCR 쿨러 랙 | ||
| DNA 샘플 준비 키트 | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 샘플 |
| PCR 마스터 믹스 | Nextera PCR 마스터 믹스 (NPM) | Nextera 키트에서 | |
| PCR 프라이머 칵테일 (PPC) | 넥스테라 PCR 프라이머 칵테일 (PPC) | Nextera 키트에서 | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| 전기영동 시스템 | Agilent 2100 바이오분석기. | G2938C | |
| 자석 비즈: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | 크기 100 장 |
| Qubit ds HS Assay Kit | 분자 프로브 | Q32854 | 500 분석 |
| 젤 추출 키트: Qiaquick 젤 추출 키트 | Qiagen | 28704 | |
| 유리 모세관 | (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm 외경) | ||
| Microforge | Narishige (또는 동급) | ||
| 시퀀서 | Illumina HiSeq 기기 | ||
| GENSAT 티로신 하이드록실라제-eGFP 마우스 스트레인 | MMRRC 재고 번호: 000292-UNC | 재고 Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/돌연변이 마우스 지역 연구 센터 |
참고문헌
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and ....
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