Co-localisation des marqueurs de cellules de la lignée et le signal de tomate
Summary
Nous avons développé deux ensembles de traçage des combinaisons dans Rosa26 tdTomato (ubiquitaire exprimé dans toutes les cellules) / Cre (spécifiquement exprimé dans les chondrocytes) souris: une avec 2.3Col1a1-GFP (spécifique à ostéoblastes) et une avec immunofluorescence (spécifique aux cellules osseuses). Les données démontrent la transformation directe des chondrocytes dans les cellules osseuses.
Abstract
Le système de traçage de la lignée cellulaire a été utilisé principalement dans les études de biologie du développement. L'utilisation de la recombinase Cre permet l'activation du rapporteur dans une lignée cellulaire spécifique et toute la descendance. Ici, nous avons utilisé la lignée cellulaire de traçage technique pour démontrer que les chondrocytes transforment directement en ostéoblastes et ostéocytes pendant os long et le développement de condyle mandibulaire en utilisant deux types de Cre, Col10a1-Cre et Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), traversé avec Rosa26 tdTomato. Les deux col10 et aggrécane sont des marqueurs bien reconnus pour chondrocytes.
Sur cette base, nous avons développé une nouvelle lignée méthode cellules traçage en conjonction avec fluorescent cellule sort immunohistochimie à définir en analysant l'expression de marqueurs cellulaires spécifiques. Runx2 (un marqueur pour les cellules ostéogéniques stade précoce) et la dentine matrice protein1 (DMP1; un marqueur pour les cellules ostéogéniques en fin de ligne) étaientutilisé pour identifier les cellules osseuses chondrocytes dérivés et leur état de différenciation. Cette combinaison non seulement élargit l'application de la lignée cellulaire traçage, mais simplifie également la génération de souris composés. Plus important encore, les statuts nombre, l'emplacement et la différenciation des descendants de la cellule mère sont affichées simultanément, fournissant plus d'informations que la lignée cellulaire de traçage seul. En conclusion, la co-application de la lignée cellulaire techniques de traçage et immunofluorescence est un outil puissant pour étudier la biologie des cellules in vivo.
Introduction
Pendant le développement, la formation osseuse endochondrale représente plus de 80% du volume du squelette. Il est largement admis qu'il commence par l'apoptose des chondrocytes hypertrophiques. Ensuite, les cellules de la moelle osseuse sous – jacente envahir et d' initier une angiogenèse, suivie par le dépôt osseux nouveau par marrow- osseuse et les cellules dérivées de 1,2 périoste. Le destin cellulaire de chondrocytes hypertrophiques (HCS), cependant, a été un sujet de débat depuis des décennies 3. Dans un premier temps, CAH ont été considérés comme la fin de la voie de la différenciation des chondrocytes, et l'apoptose a été généralement considérées comme le sort ultime de CAH. Maintenant, certains chercheurs suggèrent qu'au moins certains CAH pourraient survivre et contribuer à la formation d'os endochondral. Bien qu'ils ont proposé que la croissance des chondrocytes de la plaque avaient la capacité de transdifférencier en ostéoblastes basé sur ultrastructure, la coloration immunohistochimique, et des études in vitro 46, aucune de ces méthodes wERE définitive à démontrer la contribution des chondrocytes à la lignée des ostéoblastes.
La technique lignée cellulaire de traçage fournit une manière plus rigoureuse pour étudier le destin des cellules. Brièvement parlant, une enzyme recombinase, ce qui est exprimé uniquement dans un type particulier de cellules, stimule l'expression du gène rapporteur. De cette façon, ce type de cellule et leurs descendants sont marqués de façon permanente 7. Le système Cre-loxP est couramment utilisé dans la lignée de traçage. Cre (l'enzyme recombinase) excise la séquence d'arrêt entre les deux sites loxP et activer le rapporteur dans une lignée cellulaire spécifique (figure 1A). Dans certains cas, l'enquêteur peut choisir un point de temps favorable pour activer Cre en utilisant un médicament, comme le tamoxifène, causant Cre à fusionner à une forme modifiée du récepteur des oestrogènes (Cre ERT2) 8. reporters fluorescents sont devenus la norme dans la lignée de traçage des expériences, car ils réduisent considérablement la complexitéet d' améliorer la précision et l' efficacité du destin cellulaire traçage 8,9. tdTomato devient le meilleur choix parmi les reporters fluorescents , car il a la plus brillante protéine fluorescente et l'épifluorescence plus forte, ce qui rend facilement visualisées 7 (figure 1A).
En utilisant la lignée Rosa26 tdTomato système de traçage, notre groupe et d' autres chercheurs ont montré que CAH peut changer leur phénotype des cellules osseuses au cours du développement 10-14. Pour ce faire , nous avons développé deux ensembles de traçage des combinaisons avec Rosa26 tdTomato (expression omniprésente dans toutes les cellules) / Cre (spécifique à chondrocytes) souris: 2.3Col1a1-GFP (spécifique à ostéoblastes) et immunofluorescence (spécifique aux cellules osseuses). Les données démontrent que les deux méthodes sont des moyens viables pour étudier le destin des cellules in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison des limites technologiques, il est toujours difficile d'enquêter sur le comportement des cellules in vivo. Cependant, la technique lignée cellulaire de traçage se révèle être un outil puissant pour étudier la biologie des cellules 7-9. Dans cette étude, nous améliorons encore ce protocole en le combinant avec immunofluorescence. De cette façon, le destin des cellules peut être défini par plusieurs marqueurs associés, ce qui élargit l'application de la lignée de traça…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
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