Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.
Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.
Fluorescens mikroskopi har lenge vært anvendt for å studere effektene av transgener i sebrafisk CNS, spesielt deres effekter på utvikling en. Høy oppløsning mikroskopi har gjort en detaljert kartlegging av de cellulære prosesser involvert i hjernens utvikling, muskel generasjon, og mange andre utviklings hendelser 2. Studerer død av en enkelt celle har vært mer utfordrende, hovedsakelig på grunn av de tekniske vanskelighetene med å indusere selektiv celledød under standard bilde prosedyrer. Men kombinasjonen av encellede oppløsning bildebehandling og svært målrettet ablasjon teknikker gjør at etterforskningen av umiddelbare cellulære reaksjoner på stress og skader, samt av de påfølgende celle-celle interaksjoner. Å forstå disse prosessene er kritisk, spesielt for neurodegenerative sykdommer slik som motor neuron sykdom (MND), hvor nevron-gliaceller interaksjon har blitt vist å bidra til progresjonav sykdommen 3.
MND, eller amyotrofisk lateral sklerose (ALS), er en ødeleggende nevrodegenerativ sykdom som rammer motoriske nevroner i hjernestammen, motor cortex, og ryggmargen. Tap av disse nevronene fører til muskel tap, og pasientene dør innen 3 – 5 år med diagnosen 4. Motoriske nerveceller i ryggmargen link til muskelfibre og spiller en viktig rolle i å tilrettelegge muskel sammentrekning. Unnlatelse av denne kommunikasjonen eller død av disse nevronene gradvis svekker musklene og påvirker pasientens evne til å svelge, gå, snakke og puste. Visualisering døden av en motor neuron og de kortsiktige konsekvensene i et levende dyr gir en utmerket mulighet til å bedre forstå de dynamiske prosessene som er involvert i normal celle homeostase og sykdom.
Sebrafisk har dukket opp som et attraktivt modellsystem for å studere nevrodegenerative sykdommer 1. Detteer på grunn av de fordeler som tilbys av denne modellorganisme, slik som ytre befruktning, kort utviklings tid, optisk adgang til nervesystemet, og enkel transgenesis. I tillegg muligheten til enkelt å generere forbindelse transgen sebrafisk tillater flere strategier for merking av forskjellige celletyper. Genetisk ablasjon tilnærminger til å drepe spesifikke celletyper tillate ganske bred forstyrrelse, men mangler den fine kontroll rettet mot individuelle celler 5. Laser-assistert teknikker, på den annen side gir god temporal og spatial kontroll og har vært brukt for forskjellige dyremodeller. Mens de fleste tilnærminger bruke spesialisert utstyr, for eksempel pulserende lasere 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 eller to-foton set-ups 13, annetforskningsmiljøer har nylig tatt nytte av en UV laser i konvensjonelle confocal mikroskoper 14.
Teknikken som er beskrevet her kombinerer høy oppløsning konfokal mikroskopi med en UV-laser-mediert metode til å forårsake cellulært stress eller død i en doseavhengig måte i utvalgte motoriske nevroner. Den er avhengig av bruk av den installeres vanligvis 405-nm laser, er blitt testet med hell i cellekultur og i levende dyr, og tillater detaljert karakteriseringen av cellulære interaksjoner, for eksempel microglial klaring etter neuronal død.
Laser ablasjon tilnærminger
Laser-assistert ablasjon teknikker tillater presis målretting av individuelle eller små grupper av celler. Kombinere denne teknikken med høy oppløsning mikroskopi og genetiske manipulasjoner i dyremodeller som zebrafisk kan forskerne systematisk studere skjebnen til en enkelt celle og samspillet etter skade.
UV (405 nm) laserablasjon protokollen som er beskrevet her beskriver hvordan de enkelte celler kan bli stresset eller drepes selektivt (i en doseavhengig måte), mens nabo neuroner, gliaceller, og aksoner er igjen uskadd. Vi har med hell brukt denne tilnærmingen i cellekultur eksperimenter og beskrive her detaljert tilnærming for sebrafisk ryggmargen. Vi viser gjennomføringen av denne tilnærmingen i sebrafisk ryggmargen ved selektivt å understreke et individ nevron i et nettverk av andre celler (Figur 5, A og <strong> B), eller ved å drepe en enkelt neuron umiddelbart og uten gjenvinning (figur 5, C og D).
Tidligere spesialiserte lasersystemer, for eksempel pulset laser-nitrogen eller to-foton lasersystemer, var nødvendig for å fremkalle vevsskade og motor nerve transections 10, 11, 12, 13. Disse lasersystemer har blitt brukt til å forårsake celleskader, slik som trombose i arterier og vener 6, akutt nyreskade 7, hjerteskade 8, og å studere kalsium bølger og microglial respons etter hjerneskade 9. Videre Soustelle og kolleger brukte en konvensjonell confocal oppsett (351 nm og 364 nm UV lasere) for å indusere skader epitelial og gliaceller i Drosophila 14 </ Sup>.
Relevansen av sebrafisk Modeller for å forstå ALS (og andre menneskelige sykdommer)
Sebrafisk er en mye brukt modellorganisme, særlig for utviklingsstudier 28, 29, 30. Mens de har visse begrensninger, deres potensial for å modellere sykdom hos mennesker, og gi en forståelse av sykdomsfremkallende molekylære mekanismer er enorm. Sebrafisk modeller har blitt godt etablert for studiet av MND og har ført til viktige molekylære innsikter 31, 32, 33, 34. Transgene sebrafisk linjer kan raskt genereres (4 – 5 måneder) og la den selektive sporing av en bestemt celletype, egenskaper som gjør dem et verdifullt tillegg til dagens dyremodeller av ALS. Sebrafisk embryo / larver er optisk transparent og tilbyr unike experimentale fordeler som tillater langvarig levende avbildning på enkelt-celle-nivået i hjernen eller ryggmargen, som ikke lett kan oppnås i gnagermodeller (eller hos mennesker). Når det kombineres med molekylære teknikker, slik som enkeltcelle ablasjon, gir dette en unik eksperimentell plattform for å studere presise molekylære mekanismer in vivo.
Motoriske nerveceller kan selektivt målrettet hjelp UV laser ablasjon
Spinal nevroner i sebrafisk begynner å utvikle seg innen 10 timer etter fødselen og er etablert etter ca 48 h 35, 36. Denne raske utviklingen tillater visualisering av disse nevronene i korte tidsrammer og med høy gjennomstrømming. Motoriske nerveceller gi viktige forbindelsen mellom hjerne og muskler, og i ALS, er berørt i motor cortex (øvre motor nevroner), hjernestammen, og ryggmargen (nedre motor nevroner). Tap av disse nevronene fører uunngåelig til muscle atrofi og svakhet. Motoriske nerveceller i ryggmargen av sebrafisk kan identifiseres ved sine distinkte anslag og ved bruk av motor-neuron spesifikke arrangører som -3MNX1. Målrette cellen soma av slike utstikk nevroner avslørte antero degenerasjon langs aksonal projeksjon over tid (figur 4 og Video 1). Enkeltcelle oppløsning avbildning av spinal motoriske nevroner i tillegg bekreftet fosfatidylserin translokasjon og påfølgende Annexin V-etiketten etter laserablasjon (se figur 4 og Supplerende Video 3 i referanse 27). Selv om vi rapportere aktivering av Annexin V i døende nevroner etter vår UV laser ablasjon tilnærming, kan vi ikke være sikre på at den kaskade av døden som utløses i løpet av denne akselerert prosessen, samsvarer med neuronal død som oppstår under nevrodegenerasjon eller normal celle homeostase.
Mens dette ablasjon tilnærmingen er svært reproduserbareog bestemte, forskjellige strategier for innebygging kan også påvirke effektiviteten av UV-ablasjon. I vår erfaring, det var mest vellykket for å minimere lag av agarose vi forankret vår fisk i. Tykkere lag med innstøpningsmediet med et ekstra lag med egg vann kan redusere UV makt slutt mottatt av cellen på grunn av demping og spredningseffekter som oppstår langs strålebanen.
I fremtiden vil kryssing av ulike transgene fiskelinjer åpner for visualisering av umiddelbar og kortsiktig (opp til 12 h) reaksjoner fra andre berørte celler, for eksempel gliaceller, til laser-indusert celle ødeleggelse. For eksempel har astrocytt og ikke-autonome celletoksisitet i neurodegenerative sykdommer slik som ALS vært i søkelyset forskning og er sterkt involvert i patogenisiteten av sporadisk og familiær ALS 37, 38. Imidlertid er mekanismene som ligger til grunn glial toksisitet og selektivitetmot motor nevroner fortsatt uklare. Vi og andre nylig tok fordel av denne tilnærmingen for å studere engulfment av døende nevroner av microglia og visualisert clearance av nevrale restene 27, 39, 40.
Kombinere ablasjon teknikk med høy oppløsning mikroskopi og markører for nevroinflammasjon vil tillate forskere i fremtiden for å utvide forståelsen av enkeltcellefunksjon og sammenhengende cellesystemer. Karakterisering av disse prosesser i et in vivo miljø er kritisk, ikke bare i utviklingsmessige innstillinger, men også i modeller av neurodegenerative sykdommer, inkludert MND, hvor cellulære interaksjoner kan bli svekket 3, 41.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.
Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5% | |
Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water | ||
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
Pronase | Sigma | 10165921001 | |
Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
Microscope | Leica | SP5 | |
35mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |