Høj opløsning respirometri at vurdere mitokondrie funktion i permeabiliseret og intakte celler

Summary

Høj opløsning respirometri anvendes til at bestemme mitokondrie iltforbrug. Dette er en enkel teknik til at bestemme mitochondriske respiratorisk kæde-komplekser '(I-IV) respirationsfrekvenser, maksimal mitokondriel elektrontransport systemkapaciteten, og mitokondriel ydre membran integritet.

Abstract

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Introduction

Mitokondrier opfylde vigtige roller i cellulære energiomsætning, især ved hjælp af ilt til at producere adenosin trifosfat (ATP). De er impliceret i celledød og i flere humane sygdomme. Mitokondrie oxidative fosforylering (OXPHOS) kombinerer elektron transport langs elektron transportkæden med iltforbrug og ATP-syntese. Mitokondrie tricarboxylsyre (TCA) cyklussen er involveret i omdannelsen af proteiner, kulhydrater og fedt til energi rige forbindelser som nikotinamidadenindinucleotid (NADH) og flavinadenindinukleotid (FADH _2). Elektroner af NADH og FADH ₂ overføres derefter til de respiratoriske elektrontransportkæden proteinkomplekser (I-IV) placeret i den indre mitokondrielle membran. Derudover kan to andre redox pathways overføre elektroner til elektrontransportkæden: i) mitokondrie elektron-overførende flavoprotein (ETF) som er placeret på matrixen flade af den indvendige mitochondrial membran, og leverer elektroner fra fedtsyre β-oxidation; og ii) mitokondrie glycerophosphat dehydrogenase som oxiderer glycerophosphat til dihydroxyacetonefosfat og feeds elektroner til den mitokondrielle elektrontransportkæden. Kompleks IV (den ultimative elektronacceptor) overfører elektroner til en oxygen-molekyle, konvertere ilt til to molekyler vand. Flytning af elektronerne fra respiratorisk elektrontransportkæden kompleks I-IV kobles med proton flow fra den mitokondriske matrix til intermembrane rum, der etablerer en elektrokemisk gradient over den mitokondriske indre membran. Bagefter mitokondrie kompleks V (ATP syntase) pendulfart de hydrogenioner tilbage ind i den mitokondrielle matrix og syntetiserer ATP molekyler. OXPHOS funktion kan vurderes in vivo og in vitro under anvendelse af forskellige teknikker og forskellige mitochondriale respiration tilstande kan opnås. I isolerede mitokondrier følgende respiratorisk-ry tilstande kan måles: i) basal mitokondrie respiration (tilstand 1), ii) iltforbrug efter tilsætning af specifikke substrater af de mitochondriale respiratoriske kæde-komplekser (tilstand 2), iii) maksimal mitokondrie iltforbrug efter tilsætning af mættende koncentrationer af adenosindiphosphat (ADP) (tilstand 3), og iv) hvilende respiration efter ADP forbrug (omregnet til ATP) (tilstand 4). I intakte celler følgende respiratoriske tilstande kan måles: i) basale cellulære iltforbrug i overværelse af endogene substrater og ADP, ii) basal cellulær iltforbrug i tilstedeværelse af oligomycin (oligomycin-ufølsom respiration) og oligomycin-følsomme respiration (ATP omsætning), iii) FCCP ukoblet respiration, og iv) ikke-mitokondriel respiration efter tilsætning af antimycin A og rotenon. I permeabiliserede celler kan specifikke substrater af elektrontransportkæden komplekser og ADP tilsættes og maximum komplekse-afhængig respirationsfrekvenser such så kompleks I-, II- og IV-afhængige respiratoriske satser kan måles.

Målinger af cellulære respiration giver vigtig indsigt i mitokondrie respiratoriske kapacitet specifik for komplekser I-IV, mitokondrie integritet og energi stofskifte ^{1, 2, 3.} En af de anordninger, der muliggør målinger af mitokondrie iltforbrug med stor nøjagtighed, opløsning og følsomhed er høj opløsning oxygraph ^4. Den høje opløsning oxygraph enhed indeholder to kamre med injektion porte og hvert kammer er udstyret med en polarografisk ilt sensor. Cellular eller isolerede mitokondrie suspensioner omrøres kontinuerligt i respirometer. For at vurdere mitokondriefunktionen, substrater og inhibitorer for mitokondriel kompleks aktivitet kan tilføjes efter standardprotokoller. Substrater og inhibitorer kan titreres ved injektion into kamrene i oxygraph og forbrug ilt satser beregnes ved hjælp af software og udtrykt som picomol per sekund per antal celler. Høj opløsning respirometri giver flere fordele i forhold til traditionelle og konventionelle polarografisk oxygenelektrode enheder, herunder øget følsomhed og evnen til at arbejde med et lille antal biologiske prøver såsom intakte eller permeabiliserede celler. Derudover indeholder hver enhed to kamre, og respiratoriske satser kan optages samtidigt for sammenligninger af iltkoncentrationer. Høj opløsning oxygraph har også den fordel, reduceret lækage af oxygen fra enheden kamre sammenlignet med traditionelle polarografiske oxygen elektrodeanordninger. En anden indretning nylig udviklet til at måle cellulær iltforbrug er den 96-brønd ekstracellulære flux analysator ^5. Det ekstracellulære flux analysator er udstyret med fluorescens i stedet for polarografiske sensorer. Fordelene ved den ekstracellulæreflux analysator sammenlignet med den høje opløsning oxygraph er i) er en stort set automatiseret anordning, ii) er det muligt at måle iltforbruget i 24- og 96-brønds plader til high-throughput screening, derfor kræver mindre mængder biologiske prøver, og iii) yderligere måling af cellulær glycolytiske flux er mulig. Ulemperne ved det ekstracellulære flux analysator i sammenligning med den høje opløsning oxygraph er i) de høje omkostninger ved indretningen og til hjælpematerialer såsom fluorescerende plader, som er ikke-genanvendelige, og ii) kun fire forbindelser pr assay / brønd er injicerbare derfor er systemet ikke er muligt for substrat-afkobler-inhibitor-titrering protokoller.

I den foreliggende undersøgelse, bruger vi høj opløsning respirometri at bestemme mitokondrielle respiration. For cellulære eksperimenter forbrug oxygen cellerne permeabiliseres for at tillade optagelse af eksogent ADP og oxiderbare mitokondriske substrater til tilførsel elektroner i complexes i åndedrætsorganerne. Denne fremgangsmåde giver mulighed dissektion af individuelle mitokondriske komplekser respiratoriske kapacitet, hvilket er en klar fordel i forhold til intakte celler (mange substrater er celle-impermeabel). Dog vil cellemembranpermeabilisering forstyrre barriere mellem cytosolen og ekstracellulære rum og medium (udvaske af cytosoliske opløste stoffer) og sammensætningen af ​​det intracellulære rum ækvilibreres med det ekstracellulære medium. En af ulemperne ved permeabiliserede celler frem intakte celler er, at den mitokondriske ydre membran kan blive beskadiget, hvis store mængder vaskemiddel anvendes under celle permeabilisering. I intakte celler, basal, koblet og ukoblet respiration af intakte celler kan måles. Denne metode evaluerer oxygen forbrug af intakte celler uden tilsætning af exogene substrater og ADP, der gengiver den respiratoriske funktion i den integrerede celle og også give oplysninger om maksimal mitokondriel elektron transport kapacitet ^{6, 7.} En af fordelene ved intakte celler frem permeabiliserede celler er, at cellulære miljø ikke forstyrres, og mitokondrier er i kontakt med hele komponenter i cellerne. For at permeabilisere den cellulære plasmamembran, har detergenter såsom digitonin blevet anvendt ^8. Dog kan mitokondrie ydre membran integritet blive truet, hvis store mængder digitonin er ansat. For at bekræfte, at mitokondrier ydre membran integritet ikke kompromitteres i permeabiliserede celler, er digitonin titrering udført for at bestemme den optimale koncentration for cellulær permeabilisering. Til disse eksperimenter cellerne resuspenderes i respiration medium og digitonin koncentration bestemmes ved titrering ved respirometri i nærvær af mitokondrielle substrater og ADP og respirationsfrekvenser måles. Respiration af intakte, ikke-permeabiliserede celler ikke stimuleret i nærvær af mitochondrial substrater og ADP. Imidlertid ville efterfølgende trinvis digitonin titrering opnåelse gradvis permeabilisering af plasmamembraner, og der opnås optimal digitonin koncentration. Dette fremgår af stigningen i respiration op til fuld permeabilisering. Mitokondrie kvalitet og ydre membran integritet kan verificeres ved at tilføje eksogene cytochrom c ^{2, 9.} Cytochrom c er en 12 kDa elektron bærer proteinet ifølge den mitokondrielle elektrontransportkæden ^{10, 11, 12.} Det er lokaliseret i mitokondriske intermembrane rum, og er involveret i oxygenforbrug, transporterer elektroner fra kompleks III til kompleks IV. Når den mitokondriske ydre membran er beskadiget, er cytochrom c frigives, og mitokondriel iltforbrug reduceres. Ved tilsætning af eksogent cytochrom c, alle udbygninger i mitokondrie respiration er indikativ for enforstyrret mitokondriske ydre membran.

I permeabiliserede celler, substrater og hæmmere af mitokondrie kompleks aktivitet tilsættes efter forskellige protokoller ^{3, 9.} For eksempel for at undersøge mitochondriske kompleks-drevet respirationsfrekvenser, kan følgende protokol anvendes. Efter permeabilisering af cellerne, er første kompleks I stimuleres af substraterne malat og glutamat, som genererer NADH som substrat til det respiratoriske kæde og provokere aktiveringen af ​​komplekse I. Derefter tilsættes ADP tilsat til omdannelse til ATP (tilstand 3, aktiv kompleks I-afhængige respiration). Efter en stabil signal er nået, rotenon (mitochondrial kompleks I-inhibitor) indgivet for at inhibere kompleks I. Rotenone efterfølges af succinat til FADH ₂ og aktivere kompleks II (tilstand 3, aktivt kompleks II-afhængige respiration). For at måle kompleks IV-afhængige respiration, første kompleks III-afhængige respiration inhiberes ved tilsætning af antimycin A (mitokondriel kompleks III inhibitor). Bagefter er kompleks IV-afhængig respiration stimuleret ved indgivelse ascorbat og tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD kan auto-oxidere i respiration puffer, derfor den maksimale kompleks IV-afhængig respirationshastighed (State 3) beregnes ved at subtrahere respirationshastigheder før og efter tilsætning af natriumazid, en inhibitor af mitokondriel kompleks IV. Respirationsfaserne eksperimenter kan udføres i to kamre i en oxygraph parallelt-one tjener som en kontrol (ikke-stimulerede celler), den anden indeholder de stimulerede celler. Det er klart, at cellerne kan forbehandles på forskellige måder, fx med lægemidler, der påvirker mitochondriale funktioner, før deres iltforbruget måles i oxygraph kammeret. Denne protokol tillader funktionel undersøgelse af de enkelte mitokondrie respiratoriske kæde komplekser. Desuden kan man måle maksimal ADP-stimulerederespiration (tilstand 3) af permeabiliserede celler under anvendelse exogen fedtsyre i form af palmitat. I denne protokol, er koncentrerede lagre af natriumpalmitat konjugeret med ultra fedtsyrefrit bovint serumalbumin (BSA) (6: 1 molforhold palmitat: BSA). Bagefter celler først er permeabiliserede med digitonin og mitokondrielle respiration bedømt ved tilsætning af carnitin og palmitat efterfulgt af tilsætning af ADP (tilstand 3, maksimal respiration). Derefter oligomycin tilføjes efterligne tilstand 4 (state 4o) og respiratorisk kontrol ratio (RCR) beregnes som tilstand 3 / stat 4o. β-oxidation fremmer produktion af acetyl CoA (der træder i TCA cyklus) og generering af FADH ₂ og NADH, elektronerne hvoraf føres til elektrontransportkæden ved elektronmikroskopi-overførende flavoprotein og β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase. Mitokondrier er i centrum af fedtsyremetabolisme og beskrevet palmitat-BSA-protokol kan anvendes af forskere undersøger fedtty acid oxidation. I intakte celler, er aktivatorer og inhibitorer af mitokondrie kompleks aktivitet tilføjet efter en anden protokol ^{6, 9.} Til disse forsøg er først iltforbrug af ikke-permeabiliserede celler i fravær af eksogene substrater målt (phosphorylerende respiration sats). Derefter ikke-phosphorylerende respirationsfrekvens målt efter tilsætning af oligomycin, som er en inhibitor af mitokondriel ATP syntase. Bagefter protonophore carbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) administreret i forskellige koncentrationer og den maksimale mitokondrie ukoblet respirationsfrekvens måles. Protonophores såsom FCCP kan fremkalde en forøgelse i proton permeabilitet af den indre membran, så passiv bevægelse af protoner til at sprede den chemiosmotic gradient. En stigning i proton permeabilitet afkobler oxidative respiration (ingen ATP produktion) og inducerer en stigning i oxygen forbrug. Bagefter rotenon og antimycin A tilføjes til inhibere mitokondrisk respiration, og ikke-mitokondriel respiration subtraheres fra alle andre respiratoriske satser.

Satserne forbrug ilt kan udtrykkes som IO ₂ [pmol x sek ^-1 x 10 ^-6 celler] (ilt flow per million celler), der beregnes ved at dividere volumen-specifik ilt flux (i det lukkede ilt kammer), JV, O ₂ [pmol x ^sek-1 x ^ml-1] af cellekoncentration i celle kammer (antal celler per volumen [10 ⁶ celler ∙ ml ^{1]) 15.} Cell-mass specifik ilt flux, JO ₂ [pmol x sek ^-1 x mg ^-1], er flow per celle, IO ₂ [pmol x sek ^-1 x 10 ^-6 celler], divideret med massen per celle [mg ∙ 10 ⁶ celler]; eller volumen-specifik flux, JV, O ₂ [pmol x sek ^-1 x ml ^-1], divideret med masse pr volume [mg ∙ ml ^1]. JO ₂ er oxygen flux pr celleprotein, tørvægt eller cellevolumen.

I den foreliggende undersøgelse under anvendelse høj opløsning respirometri beskriver vi protokoller til at bestemme i) optimal digitonin koncentration for fuldstændig cellulær plasma membranpermeabilisering (digitonin titrering assay), ii) mitokondrie ydre membran integritet under anvendelse exogen cytochrom c, iii) mitochondriale respiratoriske kæde-komplekser I , II og IV maksimale respiratoriske satser i digitonin-permeabilized HepG2-celler i nærvær af exogent ADP og mitochondriale respiratoriske kæde substrater, og iv) basal, koblet og maksimal ukoblet respiration (maksimal elektron transportkapaciteten) af intakte celler uden tilsætning af exogene substrater og ADP, der gengiver den respiratoriske funktion i den integrerede celle.

Protocol

1. Cellekultur Kultur human hepatoma HepG2 celler 6 i 25 cm 2 celledyrkningskolber i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en inkubator (5% CO 2, 95% luft) (podningsdensitet: 1 x 10 6 celler pr 25 cm2 cellekultur kolbe, inkubationstid i 37 ° C inkubator: 48 timer, celledensitet på sammenflydning: 4-5 x 10 6 celler pr 25 …

Representative Results

Bestemmelse af Optimum Digitonin Koncentration for Cellulær Permeabilisering: Digitonin Titrering Experiment Digitonin titrering udføres for at bestemme den optimale koncentration for permeabilisering af HepG2-celler. Til disse eksperimenter er digitonin titreres i intakte celler i nærvær af rotenon, succinat (mitokondrie kompleks II substrat) og en mættende mængde af ADP (for at inducere kompleks II-afhængige tilstand 3),…

Discussion

Formålet med denne protokol var at bruge høj opløsning respirometri at måle mitokondrie respiratoriske kæde komplekser '(I-IV) respiratoriske satser, maksimal mitokondrie elektron transportsystem kapacitet og mitokondrier ydre membran integritet.

Der er nogle kritiske skridt i denne protokol. Først cellulær iltforbrug satser sædvanligvis normaliseret til antallet af celler (pmol / [sec x antal celler]). Derfor, før overvågning forbrug cellulær ilt, er det vigtigt at anvende en…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automated cell counting instrument
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, dissolve in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	Medium component
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemical